亚利桑那大学突破：五光子显微镜，让癌细胞无处遁形！

这项技术首次将五光子显微镜应用于实际成像，分辨率大幅提升，能在生物医学、半导体检测等领域带来革命性突破，简直是显微镜界的“超级英雄”！

 

 

原论文信息如下：

 

论文标题:
Fifth Harmonic and Five-Photon Excitation Fluorescence Multiphoton Microscopy 发表日期:
2025年04月 作者:
JOSHUA H. MAGNUS, LAM T. NGUYEN, ELANA G. ALEVY, TRAVIS W. SAWYER, SAMUEL D. CROSSLEY, KHANH KIEU 发表单位:
University of Arizona, Wyant College of Optical Sciences 原文链接:
http://arxiv.org/pdf/2504.20309v2

想象一下，如果显微镜能像超级英雄一样拥有"五倍视力"，能看到以前看不见的微观世界细节，那该有多酷？😎 亚利桑那大学光学科学学院的研究团队真的做到了！他们开发出了世界上首个第五谐波和五光子激发荧光多光子显微镜，让显微成像技术迈入了全新的境界。

 

这项技术的神奇之处在于，它不需要给样本染色或添加任何标记物，就能获得比传统方法高出22%的分辨率！这意味着在生物医学研究、半导体检测、地质勘探等领域，科学家们能够看到更多以前被忽略的细节。

图1：(A) 显示多光子过程的Jablonski能级图，包括第二、第三和第五谐波产生，以及双光子、三光子和五光子激发荧光；(B) 用于5HG/5PEF成像的MPM设计和检测方案

 

第五谐波与五光子激发荧光显微镜：一种新型无标签成像技术

 

多光子显微镜（MPM，Multiphoton Microscopy）在科学界已经不是什么新鲜事物了。从1990年双光子激发激光扫描显微镜问世以来，这项技术就在生物科学领域大放异彩。它能对厚组织样本进行非破坏性的高分辨率成像，在神经科学研究、癌细胞行为观察等方面都有重要应用。

 

但科学家们一直在追求更高的极限。三光子、四光子成像技术相继出现，而这次亚利桑那大学团队直接跳到了五光子成像，这在全球范围内还是首次！

 

什么是第五谐波（5HG）和五光子激发荧光（5PEF）？简单来说：

 

谐波过程就像五个士兵（光子）同时推一个虚拟的弹簧，然后弹簧释放出一个能量是原来五倍的超级光子

 

五光子激发荧光则是五个光子同时被吸收，激发样本中的荧光分子，然后这些分子会释放出能量稍低的光子

 

研究团队使用了实验室自建的飞秒掺铒光纤激光器，工作波长在1560纳米附近，脉冲能量小于10纳焦耳，这个能量水平低于大多数样本的损伤阈值，意味着这项技术对样本非常友好。

微创检测新突破：第五谐波与五光子成像的优势解析

 

五光子成像技术带来的好处可不是一点点！首先最明显的就是分辨率的大幅提升。根据理论计算，使用相同的物镜（20倍，0.5数值孔径），五谐波成像的横向分辨率可以达到0.738微米，而传统的双谐波和三谐波分别为1.17微米和0.952微米。

 

轴向分辨率方面，五谐波成像也表现出色，达到6.02微米，相比三谐波的8.0微米提升了24%。这意味着在三维成像时，能够更清晰地区分不同深度的结构。

 

另一个重要优势是可以使用更长波长的激发光源。五光子成像允许使用1700纳米的光源，这种波长的光在水中吸收较少，散射也较小，能够更深地穿透样本。神奇的是，即使使用这么长的波长，仍然能够激发近紫外到蓝色波长范围的荧光团，包括重要的染料如Alexa Fluor 350和405、NADH或DAPI。

 

研究团队在实际测试中发现，第五谐波信号在半导体材料（GaAs、Si和GaN）中都能观察到，而五光子荧光信号在发射波长在310-370纳米波段的样本中相当常见。这表明五谐波和五光子荧光在许多材料中都很普遍，具有广泛的应用前景。

图2：GaAs和Pentium 4 CPU芯片中THG和5HG（A、C）以及5PEF（B、D）信号的功率依赖性和光谱测量

 

从功率依赖性测量可以看出，GaAs中的5HG信号和Intel Pentium CPU芯片中的5PEF信号在对数-对数图中的斜率分别为4.9±1.3和5.5±1.7，这与预期的五阶功率依赖性基本一致，证实了确实是五光子过程。

 

光谱测量进一步确认了五光子相互作用的性质。5HG信号在310纳米处有明确的峰值，信噪比达到10分贝，带宽为4纳米；而5PEF信号在327-420纳米范围内呈现宽带特性。

深度剖析：论文揭示的第五谐波与五光子成像原理

 

要理解五光子成像为什么能有这么高的分辨率，我们需要从基本原理说起。多光子成像的理论衍射极限分辨率早就有了成熟的公式：

 

横向分辨率（半高全宽值r_xy）受到激发波长（λ）、物镜的数值孔径（NA）和多光子过程的阶数（m）的限制。随着阶数的增加，理论分辨率也会提高。公式中的m就是关键——对于五光子过程，m=5，这就使得分辨率显著提升。

 

研究团队使用了非线性刀口技术来实际测量分辨率。他们在GaAs晶片的边缘获取了SHG、THG和5HG图像，并分析了刀口轮廓。实测结果显示，第二、第三和第五谐波过程的分辨率分别为1.32微米、1.04微米和0.75微米。

图3：GaAs中SHG、THG和5HG信号的非线性刀口横向分辨率测量（A-C）。(A)由于边缘对称性破缺而出现峰值，使得SHG成为可能。GaAs边缘图像显示在（D-F）中，标尺为20微米。从GaAs表面轮廓的z-stack和拟合的高斯函数测量的轴向分辨率显示在面板（G-I）中

 

为了测量轴向分辨率，他们在GaAs表面采集了z-stack图像。通过分析GaAs z-stack的强度数据，并假设高斯轮廓进行拟合，得到了轴向分辨率。为了避免饱和效应加宽Z轮廓，他们使用了中性密度滤光片来降低功率。

 

最终测量的SHG、THG和5HG轴向分辨率分别为9.08微米、8.0微米和6.02微米。与THG结果相比，5HG的横向分辨率提高了27%，轴向分辨率提高了24%。这些测量结果与理论估计非常吻合。

 

显微镜的光学设计也很有讲究。研究团队使用了20倍0.5数值孔径的New Focus非球面物镜进行成像，这个物镜在1550纳米基本波长处有超过80%的透射率，在第五谐波波长310纳米处有18%的透射率。样本上的平均功率最大为52毫瓦，根据需要使用ND滤光片逐步降低，以避免对敏感样本造成光损伤或光漂白。

 

为了分离5HG和5PEF信号，他们使用了截止波长为510纳米的长通二向色滤光片，将小于510纳米的波长反射向PMT（光电倍增管），过滤掉515纳米到950纳米范围内93%以上的光。还使用了紫外有色玻璃滤光片，在300-370纳米范围内的平均透射率为80%，这个紫外滤光片还能将第三谐波波长衰减到OD4。

 

他们还定制了310纳米带通滤光片（透射率60%，带宽8纳米）来分离5HG信号。系统还可以通过使用在5HG/5PEF和泵浦波长范围内都具有最佳透射率的高数值孔径物镜来进一步改进，以增加信号强度。

现在让我们来看看这项技术在真实世界中的表现！研究团队将第五谐波和五光子成像应用到了多个领域，从半导体芯片到生物组织，结果令人惊叹。

 

实验结果：第五谐波与五光子成像的实际应用案例

 

首先登场的是Intel Pentium 4 CPU芯片。研究团队将芯片从封装中取出，抛光表面去除环氧树脂和顶部金属层，露出了CPU的内部结构。这些亚微米级别的结构正是多光子成像的绝佳测试对象。

图4：Intel Pentium 4 CPU。白光（WL）图像使用Olympus SZ60显微镜拍摄，A-C：CPU的THG（绿色）和5PEF（蓝色）图像。D-E：CPU的2PEF/5PEF图像。线轮廓（D和E中的红线）显示5PEF/2PEF的特征宽度分别为2.2微米和2.6微米（用⋁指示特征）。图像使用10倍0.5 NA物镜获取，样本上功率24毫瓦，像素停留时间10微秒

 

在Fig. 4A-C中，图像是THG（绿色）和5PEF（蓝色）两个通道的合成。最强的荧光信号出现在5PEF区域，同时还有一个独立的2PEF信号，有趣的是，这个2PEF信号映射出了与5PEF信号相同的CPU结构。

 

当比较2PEF和5PEF图像时（Fig. 4D-E），测量了一条线的半高全宽。2PEF通道测量的宽度为2.6微米，而5PEF通道测量的FWHM为2.2微米。这个宽度差异是由于物体尺寸（约2.2微米）与2PEF/5PEF点扩散函数的卷积造成的，清晰地展示了五光子成像过程分辨率的提升。

 

5PEF通道增加的分辨率还在图像中显示出更好的小结构对比度，如Fig. 4D-E所示。即使其他荧光通道可能成像相同的结构，五光子成像模态仍然具有明显优势。

这项成像技术可以在半导体制造层面应用，快速识别任何缺陷或在沉积层时表征层结构，从而验证制造工艺。想象一下，在芯片生产线上使用这种非破坏性检测方法，能够大大提高产品质量控制效率！

 

接下来是地质样本的惊艳表现。研究团队之前已经证明MPM在宝石和矿物成像中的实用性，而现在发现五光子过程在宝石和矿物中同样存在。

图5：绿色-THG；红色-SHG；蓝色-5PEF。A-C：分区氟石样本中结构的3D渲染，以连续角度显示（轴单位以微米计）。D：图像堆栈中的单帧，位于样本表面以下-285微米的深度。图像使用10倍0.5 NA物镜获取，样本上功率24毫瓦，停留时间15微秒

 

Fig. 5A-C显示了一个分区氟石样本的3D渲染，信号包括SHG（红色）、THG（绿色）和5PEF（蓝色）。一组图像在810微米的深度范围内拍摄，间隔3微米。5PEF信号在氟石表面以下数百微米的特征/包裹体中被发现。

 

用5PEF通道映射出的结构对这个信号通道是独特的，在其他MPM通道中不存在。因此，当使用1550纳米泵浦波长获取MPM图像时，观察这些结构的唯一方法是监测五光子发射波长。

 

这意味着地质学家现在有一种新工具来非破坏性地探索矿物内部结构，而无需切割或损坏珍贵的样本。对于宝石鉴定和地质研究来说，这简直是革命性的进步！

 

最令人兴奋的应用或许是在生物医学领域。五光子信号在人类胰腺样本中被发现，这为医学诊断开辟了新的可能性。

图6：人类胰腺组织样本。SHG – 红色；THG – 绿色；3PEF – 青色，5PEF – 蓝色。区域A、B、C在主拼接图像中高亮显示，区域D是区域C的裁剪部分。图像使用20倍0.5 NA非球面物镜获取，样本上功率52毫瓦，像素停留时间10微秒

 

成像的样本是一个未染色的7微米厚固定胰腺癌组织样本（IRB #0600000609）。MPM图像在Fig. 6中有四个通道：SHG（红色）、THG（绿色）、3PEF（青色）和5PEF（蓝色）。

 

胰腺样本的4.2毫米×4.2毫米图像是通过拼接20×20图像的网格创建的。从拼接图像中选择的位置显示在Fig. 6A-D中。

 

显著的5PEF信号在一个特征（可能是横血管）中被看到，在Fig. 6A中高亮显示，同时结构周围的SHG表明胶原蛋白的存在。在Fig. 6B-C中，5PEF信号也在结构的精细细节（可能是胰岛）中被观察到，在Fig. 6D中更详细地显示。

 

这种精细结构仅在5PEF通道中被揭示，再次证明，在这个泵浦波长下，收集五光子波长的信号是观察这些结构的唯一方法。

 

对于医学研究人员来说，这意味着他们现在有一种新工具来研究组织样本中的微观结构，而无需使用可能改变样本性质的染色剂。这可能导致更准确的诊断和更好的疾病理解。

未来展望：第五谐波与五光子成像技术的潜力与发展

 

5HG和5PEF多光子显微镜已经被证明具有可测量的更好的横向和轴向分辨率，并在各种样本中观察到显著的荧光信号。这种新型成像模态已被证明适用于甚至有利于多个科学领域的不同应用。

 

在半导体行业，五光子成像可能有重要应用。这种成像模态与其他多光子信号结合，可以成为电子电路验证和缺陷检测的有用工具。随着芯片尺寸不断缩小，对非破坏性检测方法的需求日益增长，五光子成像正好满足这一需求。

 

使用MPM作为工具的地质研究进行3D非破坏性表征可以受益于这种成像模态，因为5PEF成像允许使用散射较少的长激发波长，因此可以用于样本的更深检查，而不会影响低波长荧光信号。

 

类似地，在生物研究中，较长波长有利于更深地成像到组织样本中，以及通过五光子成像提高分辨率。这可能导致在神经科学、癌症研究和发育生物学等领域的突破性发现。

 

这种成像模态可以扩展任何现有多光子显微镜的能力。随着激光技术和光学元件的进一步发展，我们可以期待看到更紧凑、更便宜的五光子成像系统，使这项技术对更广泛的研究社区可访问。

 

未来可能的发展方向包括优化光学系统以提高信号强度，开发专门为五光子成像设计的新荧光探针，以及将这种技术与人工智能算法结合用于自动图像分析和特征识别。

 

随着技术的成熟，我们甚至可能看到五光子成像在临床诊断中的应用，为医生提供以前无法获得的组织微观结构信息，从而改善患者治疗效果。