[文献速递No.500]使用25相机多焦点显微镜进行高速3D成像

光学显微镜是生物和生物医学研究的重要工具，可以在生理条件下对细胞、组织和小型生物体进行实时、高分辨率的可视化。在过去的几十年里，神经活动的荧光指示剂通过实现神经信号传导的可视化，彻底改变了神经生物学。具有遗传表达神经活动荧光指标的线虫秀丽隐杆线虫、七鳃鳗和果蝇黑腹果蝇等小型透明模式生物是神经回路功能基础研究中广泛应用的模式生物。活体显微镜（特别是在功能神经元成像和胚胎学）中的主要挑战之一是光学显微镜本质上形成二维图像，而感兴趣的标本和动力学通常是三维。在经典的宽视场显微镜中，3D图像是通过顺序收集精细切片的2D横向的焦点堆栈形成的样品的图像平面，构建3D图像体积。可以通过使用快速压电z平台或通过远程对焦方法改变样品和物镜之间的距离来进行重新对焦。共聚焦显微镜横向和轴向扫描激光以形成3D图像。然而，即使使用高速硬件，在研究毫秒级快速动态生物事件（例如生物分子的运动、转录、扩散或神经回路活动）时，顺序获取3D图像数据的过程也可能慢得令人望而却步。这极大地限制了在3D中可视化和研究关键生物过程的能力。

光片荧光显微镜(LSFM)最近为这一挑战提供了更快的扫描解决方案。LSFM利用一层薄薄的激发光选择性地照亮和激发样品的单个平面，从而减少光毒性和光漂白。然而，LSFM和其他传统方法在时空分辨率方面存在局限性，因为仍然需要对3D体积进行顺序扫描。多焦点显微镜(MFM)的像差校正重新聚焦为同步3D成像问题提供了独特的解决方案。在这里，来自宽视场显微镜的图像光束同时通过专门设计的衍射光学元件（多焦点光栅(MFG)）进行多路复用和重新聚焦，以将整个3D焦点堆栈从样品体积投影到单个图像平面上。重新对焦的2D平面堆栈被布置在数码相机传感器上的阵列中，并在一次拍摄中捕获，无需任何形式的机械运动。由于MFG放置在显微镜的傅里叶平面中，因此保持了物镜的整个空间频率支持（光学传递函数）。数据处理最少；各个焦平面被裁剪并横向相互叠加以形成3D图像体积。连续的焦平面由均匀分布的焦点步骤隔开，该步长可以根据MFG设计中的应用进行定制。该工作以“High-speed 3D imaging with a 25-camera multifocus microscope”为题发表于期刊Optica。

虽然对任意数量的图像平面使用原始MFM色校正设计在概念上很简单，但制造成本和复杂性随着平面数量的增加而增加。因此，在没有色度校正的情况下实施了捕获九个以上同时焦平面的MFM成像系统，因此对于实时荧光显微镜来说不够灵敏。即使在单色成像中，使用单个相机捕获25个图像平面在时空采样分辨率方面也存在局限性。加州大学Miyasaki等人开发了一种像差校正、重新聚焦、多焦点25平面相机阵列(M25)显微镜来克服这些限制。M25在同步数码相机阵列上使用像差校正重新聚焦图像平面，以每秒100多个体积(VPS)的速度运行，在25个平面上同时捕获3D体积。该仪器采用简化的光学设计，使用成对衍射光栅进行色散校正。M25在对整个活体动物的荧光和明场显微镜中得到证明，体积可达50 m深，能够在其原生3D环境中可视化快速、动态的生物过程。这种无需顺序扫描即可捕获快速3D动态的方法代表了活体三维成像的重大进步。

M25显微镜采用多焦点衍射傅里叶光学器件进行像差校正重聚焦。来自商用宽场显微镜的像束通过25平面MFG[图1(a)]复用成由第零、第一和第二2维衍射阶数[图1(b)]。25平面MFG光栅功能[图1(c)]以最佳光效率（80%透射效率）和所需衍射阶之间的均匀性调整能量分布，同时将光损失降至最低，以实现高灵敏度成像。每个衍射光束重聚焦被MFG通过一个几何乱序光栅图案[图1(c)]。根据阿贝正弦条件计算无像差重聚焦的畸变函数，以校正散焦的失焦相位误差。畸变的大小决定了连续平面之间的焦点步长，并进行了调整以适应手头应用的采样和体积深度之间的最佳折衷。作者设计并测试了25平面MFG，覆盖25 m和50 m的体积深度。

图1 使用25平面相机阵列多焦点显微镜(M25)进行像差校正重新聚焦

M25光学设计的主要特点是模块化架构，用于相机阵列中的色散校正（图2）。衍射傅里叶光学器件在瞳平面上提供精确的波前控制，但由于与波长相关的衍射角而固有地引入色散。即使对于像GFP这样的单色荧光团，发射范围也跨越30-50 nm，产生径向色模糊，从而降低分辨率和峰值强度。这种效应以及制造多面棱镜光栅校正模块的复杂性限制了衍射光学器件在宽带成像中的采用。M25系统通过使用5×5个摄像头阵列来避免这些限制，每个明面都由单独的摄像头记录。每台相机（中心除外）都配备了一个定制的闪耀色度校正光栅(CCG)，与其衍射阶数的角色散相匹配。如果不进行校正，从MFG到相机的600 mm路径上的色散将导致阵列角处长达5 m的横向偏移，超过系统PSF宽度的10倍。所有25个平面的横向分辨率（图3）证实了CCG有效地抵消了这种色散。

图2 M25的色散校正架构

图3 验证分辨率、像差校正重新聚焦和高速图像采集

使用加州大学圣地亚哥分校的M25显微镜，作者探索了果蝇幼虫的多模态成像。该仪器覆盖了50×50×50 µm的成像体积，并执行荧光和明场透射（无标记）显微镜。对于明场成像，通过在透照光路中的白灯后添加窄波长带宽滤光片来修改显微镜。对表达EGFP标记的组蛋白H2B（标记细胞核）的黑腹果蝇幼虫进行成像实验。荧光成像模式[图4(a)]使作者能够跟踪细胞核，而明场模式[图4(b)]则实现了无标记成像，突出了幼虫的结构细节和运动。通过测量细胞核对之间的位移来量化心脏收缩[图4(c)–4(e)]。观察到的心率约为2次/秒。

图4 转基因果蝇幼虫的心脏的活荧光和明场M25成像表达EGFP标记的组蛋白H2B

作者使用MBLWoodsHole的M25显微镜探索了秀丽隐杆线虫的功能性神经元成像[图5(a)]。这种配置覆盖了180×180×50 m³的体积，频率为50 VPS，能够高速采集整个身体的神经活动。测量了表达GCaMP2的秀丽隐杆线虫的协调肌肉活动，以研究运动并跟踪体壁肌肉沿前后轴的钙动力学。沿身体中线插值50个等距点，并将成对的圆形ROI双侧放置在背侧和腹侧肌肉象限上。为了避免空间重叠，每隔一个片段就选择一次，产生了25个用于钙成像的ROI组。每组包括八个圆形ROI——四个在背侧，四个在腹侧——使能够量化局部肌肉活动[图5(b)和5(c)]。对于每个循环ROI和时间点，根据图像清晰度自动选择最聚焦的z平面，并从前80%最亮的像素计算荧光信号。

图5 表达荧光钙指示剂GCaMP的秀丽隐杆线虫运动过程中拮抗肌的交替激活

同时，作者使用所有50个中线点计算身体曲率，以生成背腹肌随时间变化的连续曲线图[图5(d)]。为了保持自然运动，对在线虫生长培养基(NGM)缓冲液中自由游泳的动物进行成像，而无需固定。这种设置允许在主动运动期间不受阻碍的运动和可靠测量特定肌肉亚群中的钙动力学。秀丽隐杆线虫通过背腹起伏推动自身，产生向前和向后的运动、停留和静止状态。这种行为是由拮抗肌沿身体轴的交替收缩驱动的，并由以不同时间频率放电的运动神经元协调。高速体积记录清楚地捕捉到了这种交替[图5(e)]，支持对不受约束的动物的运动动力学进行准确量化。这些图案可以完善移动控制的计算模型并揭示复杂的行为，例如重新定向期间的滚动动作。

接下来，作者对具有泛神经元核GCaMP6s表达的秀丽隐杆线虫OH1625动物进行了成像。这允许随时间跟踪单个神经元[图6(a)]。M25系统在180×180×50 m³的体积上以43 VPS的速度采集数据，大到足以容纳整个移动的动物。使用StarDist3D分割动物中央部分的神经元，并使用ultrack进行跟踪，以随着时间的推移连接神经元。与图5类似，动物可以在观察到的体积内自由移动[图6(b)，同时跟踪单个神经元超过20 µm。

作者还以更高的放大倍率，M25设置为16VP的OH1625 C.秀丽隐杆线虫动物的头部成像，以定量观察单个神经元随着时间的推移（图7）。同样，使用Stardist3d分割所有平面中的神经元。然后，使用Trackpy随着时间的推移将神经元连接起来，并分析钙活性行为。对轨道进行过滤（以上超过50％的时间范围存在），并显示动物随时间的一般运动（图7）。从两个不同的Z平面中选择了两个代表性神经元，然后绘制了它们随时间的归一化强度[图7(c)和7(d)]。神经元1在大约7 s的时候表现出了强烈的钙峰值，而神经元2在记录时间内表现出多个小的峰值。

图6 秀丽隐杆线虫的快速运动和单个神经元的跟踪

图7 秀丽隐杆线虫头部的神经信号成像，使用较小的M25视场获得，体素大小为0.156×0.156×2.0 µm

原文链接：

https://doi.org/10.1364/OPTICA.563617