突破分辨率极限！这款“细胞透视镜”，超清+三维成像同步搞定

光学显微镜因具备非接触、无损伤观测样本的优势，在生物医学领域被视为一种窥探微观世界奥秘的关键工具。尽管可观测样品种类丰富，但传统光学显微镜存在空间分辨能力的局限性，直到超分辨光学成像技术成功问世，这一限制才被真正打破。近日，一项来自意大利理工学院的工作，让超分辨成像再次迎来重大突破——该研究团队通过技术创新，在无需复杂光学系统设计的前提下，首次实现了超分辨成像及光学切片，让生物学家拥有了窥探细胞生命奥秘的“透视之眼”。（新闻来源：IIT reveals details of thick and complex living tissues）

自1665年诞生，光学显微镜就被广泛应用于微细胞结构的观测中。在近400年的发展历程中，这项技术的性能指标也在不断优化提升，但阿贝极限（光学显微镜空间分辨率的极限，不高于可见光波长的1/2）的存在，将空间分辨率的上限“锁定”在200 nm的水准上，使其无法观测到诸如病毒、生物大细胞等细微生物体的生命行为。随着激光技术的不断发展，有科学家另辟蹊径，通过激光激发荧光标记，同时进行多次逐纳米扫描，成功研制出空间分辨能力在数十纳米的超分辨荧光显微镜。这项发明获得了2014年诺贝尔化学奖，也开辟了超分辨成像的全新局面。

图1 高速超分辨显微镜：(a) 实物照片; (b)-(c) 成像探测结果.

在激光技术的加持下，超分辨成像技术领域的“新秀”也不断涌现，共聚焦激光扫描显微镜 (CLSM) 就是其中的翘楚。CLSM技术通过引入针孔结构，排除离焦光线，从而获得清晰的图像。针孔直径越小，最终能够收集到的离焦光线就越少，图像的横向分辨率就越高，最终突破衍射极限的尺度限制。尽管可以轻松实现百纳米尺度下的精确成像，但在面对较厚的生物组织时，CLSM技术则显得“力不从心”。生物组织内多层结构会引入大量背景光，导致最终成像图像噪声增多，成像模糊不清。

而图像扫描显微镜(ISM) 通过以探测器阵列替换针孔及单元件探测器的方式，在一定程度上对图像信噪比及横向分辨率实现了优化，实现对CLSM技术的改进。在此基础上，科学家开始探索光学切片（即三维成像）的可能性，但光学切片深度与成像信噪比之间的权衡问题始终存在。此次意大利理工学院研究团队从重新设计样本反射光的收集方式入手，开发出了全新的超分辨切片图像扫描显微镜技术 (s²ISM)，该技术将共聚焦激光扫描显微镜与探测器阵列相结合，打破了传统技术的诸多限制，实现了高分辨、大信噪比与深光学切片等多项优势的集成。

该团队首先基于传统ISM显微镜光路（如图2 (a)）进行了一定技术升级。为精确采集观测图像，他们采用单光子雪崩二极管 (SPAD) 作为探测器阵列，该探测器阵列不仅能够记录光子击中组织样本的空间位置，还能够对光子在样本中的传播路径进行追踪，最终获得较高的空间及时间分辨精度。相较于传统探测器，SPAD的核心优势在于单光子敏感性，时域分辨能力以及低噪声特性，所以适合捕获较弱信号。而在较厚组织的散射及吸收作用下，反射光信号强度通常极为微弱，而这恰恰是SPAD的用武之地。

图2 ISM：(a) ISM显微镜结构示意; (b) 聚焦、散焦位置点扩散函数(PSF)模拟; (c) ISM图像采集示意; (d) s²ISM与ISM成像对比

研究团队观察到，使用SPAD阵列成像时，原始数据中其实已经内嵌了关于样品的深度信息（离焦光在探测器边缘更亮），只是此前未被充分利用。基于这一关键发现，该团队设计了一种直接的重建算法，通过逆向求解ISM成像的物理模型，将信号分为聚焦及非聚集两部分，通过融合和去卷积扫描图像中的聚焦信号，生成清晰的超分辨率图像。根据理论模型的计算结果，单次扫描下显微镜的成像分辨率提升至衍射极限的1.7倍，光学切片能力翻倍，成像信噪比也获得了40%以上的提升。在理论优势凸显的前提下，该团队基于真实样本，进行了显微镜成像的性能验证，对比结果如图所示：s²ISM成像方式，无论在何种对照方式下均有较好的表现。

图3 不同成像模式空间分辨及光学切片对比：(a) 共聚焦与s2ISM重建模式下HeLa细胞的成像对比; (b) 不同算法重建图像的细节对照; (c) 渐进间距线成像对比；(d) 调制传递函数; (e) 不同成像方式在z方向成像对比; (f) 归一化的光学切片函数

s²ISM 技术不仅在结构成像方面表现卓越，在荧光寿命成像(FLIM) 领域也有着较为广阔的应用前景。如图 所示，研究团队充分利用 SPAD 阵列探测器的单光子计时能力，在FLIM实验中推广了适用于荧光寿命成像的算法。FLIM能够提供生物组织的功能信息，不同分子的荧光寿命不同，通过分析荧光寿命，科学家可以了解分子的环境、相互作用等信息。s²ISM 技术下的FLIM，进一步提升了寿命分析的精度，为深入探索生物分子动态提供了更强大的工具。

图4 基于s²ISM技术的FLIM：(a) 模拟不同寿命管蛋白丝的成像结果；(b) 马氏根样品实验图像观测结果; (c) HeLa细胞实验图像观测结果

在基础生物研究领域，s²ISM技术为科学家们打开了一扇全新的大门。它能够助力深入研究脑组织、肿瘤、类器官等复杂生物系统。例如在研究脑组织时，而s²ISM技术凭借其高分辨率和强大的光学层析能力，可以清晰呈现神经元的结构和连接，帮助科学家更好地理解大脑的神经回路和功能，为神经系统疾病的研究提供关键线索。

正如研究团队所说：s²ISM技术不仅是显微镜的升级，它将为医学和生命科学领域带来一系列突破性进展，推动相关学科的快速发展。在未来，随着该技术的进一步普及和应用，生物学家或许能够因此而更深入地理解生命的奥秘，攻克更多的疑难病症，为人类的健康事业做出贡献。

这项杰出的研究成果，是先进成像技术改变未来的生动缩影。中国激光杂志社长期致力于在全球范围内传播光学与成像领域的前沿突破，Advanced Imaging (AI)由中国科学院上海光学精密机械研究所主办，西安电子科技大学杭州研究院共同主办，中国激光杂志社出版。法国索邦大学Sylvain Gigan教授、中国科学院西安光学精密机械研究所邵晓鹏教授和中国科学技术大学徐飞虎教授担任共主编，致力于发表成像及相关领域内的高水平基础和应用研究进展，推动先进成像技术的快速发展，增强该领域国内外的学术交流合作，促进科研成果的转化。欢迎大家投稿！

参考论文：

Zunino, A., Garrè, G., Perego, E. et al. Structured detection for simultaneous super-resolution and optical sectioning in laser scanning microscopy. Nat. Photon. (2025).