热驱动智能微透镜阵列：实现斑马鱼活体脑神经元高速三维动态成像

荧光显微成像新策略TAS:

三维动态捕捉斑马鱼活体脑成像

理解大脑如何通过神经元网络的信息流动产生复杂行为，是神经科学研究的核心问题之一。这需要在活体状态下，以细胞和毫秒级的分辨率记录大范围且相距较远的脑区神经元活动，从而全面观察其活动模式。然而，在显微成像中，当需要精确的空间选择性时，高速捕捉三维信息仍然是一个挑战。传统光学技术无法直接将二维平面相机传感器与复杂的三维区域（如大脑表面或神经元层）进行有效结合。此外，大多数神经元连接指向大脑内部的深层结构，研究跨层连接性需要同时监测位于不同深度的神经元。活体神经元活动的光学记录通常通过基因编码钙指示剂(GECI)/基因编码电压指示剂（GEVI）实现。最新一代的GECI可以揭示低至数十毫秒的快速钙瞬变，而GEVI则能够解析亚阈值活动和单个动作电位（毫秒级）。无论是哪种情况，监测短暂且相对微弱的荧光爆发都需要快速且灵敏的采集系统。虽然现代相机的采集速率（0.1-1 kHz）不是限制因素，但这些指示剂的光子产量有限，要求优化光子收集并最小化噪声和背景干扰。

尽管光片显微镜、结构光照明显微镜、目标照明显微镜、单光子共聚焦显微镜和双光子显微镜等技术已经部分满足了这些需求，但在高体积速率下沿第三维度（z轴）获取信息并保持良好的光学切片能力仍然复杂且难以实现。这些需求推动了多种研究策略的发展，每种策略在速度、信噪比（SNR）、可访问体积、分辨率、光子预算以及仪器复杂性之间都有各自的权衡。

荧光信号的强度通常较弱且持续时间短，系统的色差、衍射和偏振损耗会限制荧光光路的形状，因此需要高灵敏度、低噪声的成像系统。策略选择常受困于离焦背景干扰、光子采集效率限制及机械扫描速度瓶颈三大挑战。

近期，法国索邦大学与苏黎世联邦理工学院团队通过使用一种用Phasics SID4波前传感器精确表征相位的智能微透镜阵列，提出了一种新型波前整形策略:  热自适应表面显微镜策略(Thermally Adaptive Surface Microscopy Strategy，后文中均使用TAS显微镜策略)，成功达到0.5千赫兹的采集速率，在360×360 μm²视野范围内，轴向聚焦范围91 μm，且实现了对斑马鱼幼体的活体脑成像不同脑区深度神经元活动的三维同步捕捉。

TAS显微镜策略的整套设备无双折射，几乎无衍射伪影和色差，并且光学损耗极低，这对于荧光成像中的光子预算至关重要。

TAS显微镜策略能够以高采集速率以及高空间分辨率同时成像分布在多个平面内的荧光微观物体。这种无扫描策略利用热光效应，在视场内的多个区域独立控制焦点。

智能微透镜阵列（SL）的核心构成及原理

采用氧化铟锡（ITO）制作的螺旋形微导线，通过紫外光刻工艺在玻璃基底上形成导电结构。导线宽度局部缩小以增加电阻，通过焦耳效应产生可控的局部加热。在ITO导线上覆盖一层500 μm厚的聚二甲基硅氧烷（PDMS）的热光介质层，其负热光系数（dn/dT = -4.5×10⁻⁴ K⁻¹）使得加热区域折射率降低，形成可调发散透镜效应。每个微透镜单元直径约540 μm，通过独立电压控制实现局部聚焦调节。

图1 ：TAS显微镜策略的核心构成与表征。

a) TAS显微镜的光学设计。IP=中间像平面，LT=管镜。中间插图：智能微透镜阵列在中间像平面IP（灰色虚线）附近引起的焦点偏移Δz（红色虚线）。底部插图：智能微透镜阵列在样品空间引起的焦点偏移Δz′。顶部插图：由于激发光和收集的荧光都通过准消色差智能微透镜，每个子视场（subFOV）无论施加何种离焦都保持与相机平面共轭。(b-c) 单个PSF（激发光）在智能微透镜耗散功率Pe = 0、0.1和0.21 W时的图像，分别沿(x,z) (b) 和(x,y) (c) 平面。(d) 样品空间中的焦点变化Δz′和子视场放大率随电功率的变化。(e) 样品空间中PSF光束腰尺寸𝜔0𝑥和𝜔0y随离焦Δz′的变化。(f) 沿z轴的光强截面随距离z的变化，颜色表示相应的瑞利长度zR。(g-I)智能微透镜阵列引起的热相移图像与实验图像。

TAS显微镜策略的工作原理是由一束准直的激发激光（λ=473 nm）照射到数字微镜器件（DMD）的表面。DMD通过一个远焦系统与中间像平面（IP）共轭，并重新成像到显微镜物镜（20倍率，NA=0.5）的（x,y）样品平面中。样品的单光子荧光信号由同一物镜收集，视场为360×360 μm²，经过长通二向色镜（截止波长λ=500 nm）和带通滤波器（520±28 nm）滤波后成像于相机上。DMD与测试样品平面（x,y）共轭，能够对测试样品进行图案化照明，从而实现目标照明或结构照明。每个激活的智能微透镜区域在样品空间中定义一个典型的子视场，并可在其中引入离焦。通过调节每个智能微透镜阵列的局部加热功率，可以独立控制其在样品空间中的焦点位置和成像表面，实现在三维空间内的多平面成像与自适应调节。

图2:TAS显微镜策略的原理

a 单个热微执行器智能微透镜的光学图像（反射模式下获取）。b 施加电功率（Pe=0.2 W）时，智能微透镜内部的温度分布图，显示热响应聚合物（PDMS）中的折射率调制。c 使用高分辨率波前传感器（λ=532 nm）测量的相位偏移，表明单个智能微透镜在局部起到微透镜的作用。d 单个智能微透镜的屈光度随供电功率的变化，展示了三种不同波长下的低色差特性。e 基于智能微透镜阵列的TAS显微镜原理图。f 单个智能微透镜的透射光谱，显示低损耗特性。g 表达GCaMP8m钙指示剂的斑马鱼幼虫的复合荧光图像。h-j 斑马鱼尾部的荧光图像。彩色方块标出了每个智能微透镜对应的活动区域（样品空间中约70×70 μm²）。

SID4对智能微透镜阵列的相位表征及验证

TAS显微镜策略的技术核心智能微透镜阵列，其性能验证依赖于Phasics SID4高分辨率波前传感器以及其核心四波横向剪切干涉法。

表征过程使用卤素灯作为光源，经光谱滤波（λ=605 nm，Δλ=55 nm）和空间滤波（NA<0.1）提供高空间相干性照明。通过显微镜物镜（×4，NA=0.1）将智能微透镜阵列成像至SID4传感器，捕获干涉条纹。

SID4传感器直接测量由智能微透镜阵列加热引起的相位畸变(如图2c)，并通过解卷积算法分离相位格林函数（𝐺𝜑）和热格林函数（𝐺𝑇=1/(4πκr)），反演温度分布与焦耳耗散功率（如图2b）。通过调节智能微透镜阵列的加热功率（0–0.2 W），量化相位变化与焦距调节范围（0至-80 m⁻¹），验证其热扩散特性与响应时间（τ≈500 ms）。

为何选择Phasics SID4 系列？

TAS研究中，SID4的高精度相位测量为智能微透镜阵列的低色差设计和偏振无关性提供了关键验证，这些特性直接提升了荧光成像的信噪比和稳定性。可直接解析微米级相位梯度（图2c），避免传统干涉仪对振动敏感的问题。SID4系列产品具有宽/多光谱兼容性，支持复杂波前畸变的实时分析，且具备非侵入性，可无标记、全场定量相位成像，无需破坏样本，完美适用于活体动态监测与多波长荧光成像。

除相位成像外，Phasics设备可同步测量并量化波前畸变、光学像差、MTF，PSF以及材料热力学特性（如PDMS的热扩散系数），结合解卷积算法，还可扩展至动态热成像。