基于图像的干涉焦点感应波前校正方法实现双光子显微镜中大视场大深度图像质量优化

图1 基于图像的干涉焦点感应（IBIFS）方法原理图

在生物医学成像领域，尤其是深层组织成像中，样品的散射和系统的像差会严重降低图像质量并限制成像深度。自适应光学（AO）技术通过补偿波前畸变来提高成像质量，最早在天文学中用于校正大气湍流的影响，后被引入显微成像领域以校正像差和生物组织的散射。目前双光子显微成像领域最常见的AO方法是Zernike模式分解法，使用Zernike多项式作为表示像差的模式相位，使用图像强度的均值作为评估参数，在物镜的入瞳共轭面上使用空间光调制器（SLM）依次加载模式相位，根据评估参数的变化计算模式相位的系数来获得校正相位，最后使用SLM加载校正相位来补偿像差。这种方法仅仅对于较弱的像差有较好的补偿效果，由于SLM放置在物镜的入瞳共轭面，受光学记忆效应范围的限制，校正相位仅仅对于一个小区域视场有较好的效果。

针对上述问题，近日中国科学院西安光机所姚保利研究员团队在Nanophotonics发表最新文章，提出了一种针对深层组织显微成像的大视场波前校正方法（如图1所示）。该方法利用全视场图像信息评估参数作为干涉焦点感应方法的输入，获得了更稳定的校正效果，实现了大视场范围内的图像质量优化。该方法被应用于共振扫描振镜双光子激发荧光显微成像系统中，通过对荧光小球和小鼠脑神经切片样品的成像证明了其有效性，实现了对较强像差和散射体的大视场波前校正，展现出高稳定、抗干扰的特点，为脑科学、发育生物学等领域提供一种增强的显微成像工具。

在显微成像领域，样品的散射和系统的像差不仅会降低图像的分辨率和信噪比，减小成像视场，还会限制成像深度。为了克服散射和系统的像差的干扰，科研人员开发出了多种策略，其中两种方法比较常见：1）、使用较长波长的激发光源，例如双光子显微镜（TPM）。长波长的光源在穿透生物组织时受到的散射影响较小，这使得它们能够实现更深的成像深度。2）、采用自适应光学方法，通过调制入射光束的波前来校正成像系统的像差，从而显著提高成像质量。将双光子显微镜与AO方法相结合，可以显著提升显微成像的性能，成为近年来的热点研究方向之一。

AO技术可以分为直接法和间接法：直接法使用波前传感器直接获取波前畸变；间接法则是使用波前校正器加载一系列的测试相位，根据图像质量的变化迭代计算出校正相位。直接法的优点是校正速度快，而间接法的优点是系统简单，不需特定的信号参考点作为导星，更适合生物组织成像中的散射补偿。间接法AO需要根据图像参数进行反馈优化校正相位，然而随着生物组织成像深度的增加，由于光学记忆效应范围限制的影响，通常加载在物镜的入瞳共轭面上的校正相位只能够校正较小区域的视场。因此针对于深层组织成像的AO算法，例如干涉焦点感应法（IFS），往往只能采用样品中的某一个特定位置的强度信息作为反馈信号。对于稀疏的三维样品而言，找到一个合适的参考点并不容易，一个很可能出现的情况是由于参考点信号不好而导致校正结果较差。另外，在TPM这一类扫描成像系统中，为了获得某一个特定位置的强度信息，需要将系统保持静止，先进行像差补偿，再进行成像，校正和成像无法同时进行。

针对上述挑战，研究人员提出了基于图像的干涉焦点感应（IBIFS）方法。该方法采用共轭自适应光学配置，通过监测图像质量指标的反馈来逐步估计和校正整个视场的波前。其创新点是将基于图像的评估参数和干涉焦点感应算法相结合，并通过共轭自适应光学系统配置，增大了有效校正区域的大小。IFS作为一种点扩散函数优化算法，比传统的Zernike模式分解法更适合校正深层组织成像中的强像差。IBIFS通过结合基于图像的评估参数，可以更稳定地改善图像质量，在成像过程中实时像差补偿，校正更的大视场。此外，为了更快地获取全视场图像信息，系统中使用了共振扫描振镜。相较于电流计扫描振镜，共振扫描振镜可以实现更快的扫描成像速度（45 fps@512像素×512像素）。

图2 荧光小球样品的散射校正实验结果

IBIFS实现了较大视场范围的像差校正，图2展示了荧光小球样品的散射校正实验结果。可以看出基于小区域信号的校正策略（ROI-based）仅仅对于参考点B1附近的视场有比较好的校正效果，而IBIFS策略（MHF-based）可以利用全视场的图像信息反馈调节校正相位，具有全视场的校正效果。从图3展示的小鼠脑神经切片样品散射校正实验结果中，可以看出基于小区域信号的校正效果依赖于参考区域的样品结构分布，很可能会出现没有校正效果或者局部优化效果较好但是全局优化效果较差的情况。IBIFS避免了上述问题，实现了更稳定的校正，并且校正后的图像总强度增强倍数比基于小区域信号的校正方法更高约37%。

图3 小鼠大脑切片样品的散射校正实验结果

研究团队提出的基于图像的干涉焦点感应（IBIFS）方法在生物医学成像领域具有潜在的应用前景。随着技术的进一步发展和优化，结合其它成像技术和方法，有望在复杂生物样本成像中发挥重要作用，为研究深层生物组织结构和功能提供有力支持。

该研究成果以“Wavefront correction with image-based interferometric focus sensing in TWo-photon microscopy”为题在线发表在Nanophotonics。