激光共聚焦显微镜中的共振扫描

激光扫描共聚焦显微镜已被证明是一种有用的工具，用于检查固定和染色的细胞，组织，甚至整个生物体在高对比度下，通过消除从焦平面移除的区域产生的光。然而，荧光蛋白在活细胞成像中的应用越来越多，现在需要毫秒级的显微镜成像速度，以揭示许多生物过程中发生的复杂动力学。遗憾的是，传统的激光扫描共聚焦显微镜的采集速度受到振镜的限制，振镜是由一个线性锯齿控制信号驱动的，速度为每像素几微秒。这意味着扫描速率范围从500毫秒到2秒，具体取决于图像尺寸。为了在更快的时间尺度上获取图像，激光扫描共聚焦显微镜必须重新设计，以纳入先进的扫描方案，使光束能够以更高的速度光栅扫描穿过标本。为了克服共聚焦显微镜固有的慢速，一些制造商引进了配备共振扫描镜的仪器，能够以每秒30帧或更高的速度收集图像。

图1-带线性和谐振电流计混合扫描系统的激光共焦扫描单元

图1所示的是一个尼康A1R激光共聚焦显微镜扫描单元配备了许多先进的功能，包括一个高分辨率振镜扫描仪(4096 x 4096像素；非谐振)和高速谐振扫描仪，一个连续可变的六边形针孔，光谱成像能力，几个光输出端口，以及一对不同波长的多个激光器的输入端口。在A1R MP（多光子模型）中包含一个额外的自由空间光束引入端口，用于多光子成像所需的超快激光器。谐振扫描系统能够以从每秒30帧（512 x 512像素）到每秒420帧（152 x 32像素）的速率进行高速图像捕获，而非谐振扫描仪具有以512 x 512像素每秒4帧的最大扫描速率。谐振扫描仪的共焦变焦（从1.5倍到8倍）受到每一步单独的Ronchi光栅图案的要求的限制（下面讨论），而非谐振扫描仪具有1倍到1000倍的连续可变变焦范围。也许A1R扫描单元最先进的功能是能够同时使用两台扫描仪进行混合扫描。在这种模式下，可以使用非谐振扫描仪对样品的选定区域进行光激活或光漂白，然后使用谐振扫描仪进行高速成像，实时观察光激活物种的恢复或扩散情况。该仪器的真正力量在于多种功能，使高分辨率共聚焦成像固定标本和实时扫描与可选的光激活活细胞成像使用荧光蛋白，光学荧光笔，和笼状荧光团。在预算有限的显微镜核心设施中，这种多功能性应该能够在单一仪器中容纳更广泛的用户基础。

虽然相对复杂的谐振振镜已经在商业上可用了三十多年，但它们在激光扫描共聚焦显微镜中的应用尚未得到广泛应用。20世纪90年代初，第一批点扫描仪器是在希望对活细胞中的快速钙波成像的研究人员的实验室中制造出来的。在几份描述成功实验的研究报告出现后，其他研究人员开始开发更复杂的仪器，包括包含共振扫描仪的多光子共聚焦仪。共振扫描显微镜的构造由于高速共振扫描仪的余弦运动而变得复杂，这就产生了像素时钟问题。然而，在过去的十年中，已经出现了一些可行的解决方案（基于硬件和软件），使仪器能够以视频速率执行正常的共聚焦功能，例如平移和缩放。这些仪器在未来几年应该会越来越受欢迎，并且毫无疑问能够在速度和成像效率方面与旋转磁盘和线扫描仪竞争。

在传统的激光扫描共聚焦显微镜中，激发光束被扩展并引导到一对振荡振镜扫描镜上，该扫描镜对聚焦光束进行光栅扫描。在进入光电倍增管检测器之前，通过相同的反射镜组对荧光发射进行反扫描，并通过共轭（共聚焦）针孔孔径去除失焦光。在扫描和反扫描过程中，一个振镜镜沿着快速的水平轴扫描样品，而另一个振镜镜扫描并跟踪较慢的垂直轴。扫描继续进行，直到收集到完整的二维（x-y）图像，随着时间的推移，这个过程可以重复以生成一系列图像。或者，焦点可以沿着显微镜轴向平面步进，以获得光学切片的三维（x， y和z）图像堆栈。扫描速度受到快轴反射镜的机械规格的限制，它通常以每像素大约4到5微秒的速度扫描。因此，对于在一秒内采集的512 × 512像素图像，扫描点在每个像素上驻留约4微秒。以视频速率（每秒30帧）驱动标准振镜扫描仪来收集类似大小的图像是困难的，如果不是不可能的话，因为镜子必须快速加速，在扫描整个领域时保持恒定速度，然后迅速减速并反转行进方向，对每条扫描线重复这个循环。以每秒30帧的速度尝试这样的动作可能会导致过热和过早失效。因此，非共振线性振镜所要求的慢扫描速率限制了共聚焦显微镜观察在非常快的时间尺度上发生的事件的能力。

快速样本扫描的方法

使用基于振镜的激光扫描共聚焦显微镜，最快的扫描场景包括使用线扫描沿着样品的单个轴获取一行像素，同时使用快轴反射镜将慢轴反射镜置于选择适当位置进行扫描（图2）。在现代共聚焦仪器中，扫描线不限于x轴，但可以定向在任何横向方向，以包括所有感兴趣的样品特征。结果通常绘制为一系列扫描，偏移使荧光强度随时间变化的可视化。这种方法可以产生高速扫描，但其检测可能发生在标本其他区域的事件的能力有限。快速线扫描的另一个缺陷是，每个像素上的停留时间通常不足以激发所有可检测的荧光，特别是对于目标丰度较低的样品。此外，共聚焦显微镜中使用的光电倍增管的量子效率范围约为15%至40%，因此随着扫描速度的增加，每像素检测到的光子数量可能会在一些样品中下降到被光电倍增管的噪声底所掩盖的水平。

图2所示为活细胞行扫描共聚焦显微镜的例子。图2(a)所示的序列捕获了由合成指示剂Fura Red在心肌细胞中诱导的钙火花的x - t扫描系列。注意在序列中连续时间点的几个位置出现的高荧光强度区域。在图2(b)中，使用荧光蛋白cameleon生物传感器探针（含有mCerulean和mVenus）显示了钙波在分离的HeLa细胞中穿过细胞质的图像。获得高空间分辨率的图像（例如512 x 512像素）需要快速的x-y扫描，并且必须使用可以在毫秒内扫描整个领域的显微镜进行，例如以下段落中描述的仪器。使用配备线振镜的共聚焦显微镜进行快速线扫描，钙波可以在一维上作为时间的函数记录下来，如下图所示。在图2(c)中，沿着图2(b)中的白色虚线进行扫描，以捕获波的单个空间维度，波在不到一秒的时间内通过细胞。

图2-线扫描共聚焦显微镜

另一种快速图像采集策略包括增加像素停留时间而不降低帧速率，方法是将照明光束塑造成一条线，同时在一个轴上激发荧光团，同时沿着另一条轴扫描样品，以中等镜像速度实现视频帧速率（图3(c)中示意性地示出）。这种扫描概念已经在一种商用共聚焦仪器中实现，该仪器消除了快轴振荡振镜，并使用线性CCD阵列（line-CCD）捕获荧光发射。因此，线扫描共聚焦显微镜可以通过线状照明激发并通过共聚焦狭缝孔径收集荧光发射来实现视频帧率。线扫描共聚焦仪器的实际限制是不对称的分辨率，这是由于一个轴的分辨率是由共聚焦扫描提供的，而另一个轴的分辨率是由传统的宽视场光学限制的。此外，在技术上很难产生窄的衍射限制线的聚焦光与适当大小的检测狭缝耦合在分辨率不显著低于理论的最佳。

商用狭缝共聚焦显微镜的解决方案依赖于使用不同宽度的狭缝孔径（以改变共聚焦的程度），这些狭缝孔径是通过在光学玻璃上沉积不透明材料的薄膜来制造的。扫描照明是由圆柱形透镜元件形成的光楔，该透镜元件以由物镜的数值孔径决定的角度汇聚在焦平面上。如前所述，狭缝扫描仪器能够在分辨率下进行高速图像采集，仅受图像点扩散函数在轴向上的轻微退化的影响。缺点是，狭缝扫描仪目前依赖于线性单像素CCD探测器，其量子效率和噪声特性与科学级CCD相似。这些探测器远不如电子倍增ccd （emccd）灵敏，因此需要更高的激发能量才能达到相似的信噪比。结果是在活细胞成像中快速的光漂白和高水平的光毒性，这限制了在伪影开始模糊实验结果之前可以获得的扫描次数。通过引入先进的互补金属氧化物半导体（CMOS）或emccd型线性电荷耦合器件图像传感器，线扫描共聚焦显微镜将得到极大的改进。

一种更先进的高速共聚焦成像方法包括用多个平行光束扫描样品，这些光束由旋转的尼普科夫旋转盘形成，或者通过扫描样品上的网格阵列来平行捕获所有图像点。设计后一种仪器的关键要素是创建一个网格模式，能够在一次扫描运动中扫描整个场，同时保持照明和检测针孔在足够大的分离距离上，以防止针孔之间的荧光发射串扰。尼康“LiveScan”扫描场共聚焦显微镜是多点阵列扫描仪的一个很好的例子，它提供了具有不同针孔尺寸的可选网格的额外细化。该系统还可以选择使用一组不同宽度的狭缝，以降低共焦度为代价，提供最大的激发能量和发射收集效率（图3(b)）。在操作中，使用快速振镜和压电元件组合来控制镜子并以视频速率捕获图像，将32个照明点的网格扫过样品场。在狭缝扫描模式下，扫描场共聚焦显微镜能够以接近每秒1200帧的速度捕获图像。该仪器还能够使用声光可调滤波器（AOTF）激光控制，专用多波段二色镜和匹配的滤光片组进行多色荧光成像。此外，该显微镜可与高性能、低噪声的EMCCD相机系统相结合，以最低的激发能对活体标本进行最有效的成像，从而最大限度地减少光漂白和光毒性。

图3-高速共聚焦显微镜扫描机制

尼普科夫圆盘式旋转圆盘共聚焦显微镜为活体标本的快速扫描提供了一个极好的选择。这些仪器是基于一个圆形的旋转磁盘，其中包含一个或多个针孔阵列，排列成阿基米德螺旋，设计用于在单次磁盘旋转期间扫描整个标本平面（或更少的设计）。旋转盘显微镜也可以操作狭缝而不是针孔，其代价是轴向分辨率降低。先进的旋转磁盘系统采用双磁盘，双磁盘包含位于上磁盘针孔阵列上方的微透镜元件，其作用是将入射激发照明聚焦在下磁盘相应的针孔上，从而显着增加光吞吐量（如图3(a)所示）。这种类型的仪器通常被称为场、线或阵列扫描仪，因为它们在获取每张图像期间多次扫描场上的照明点或线阵列。旋转磁盘显微镜的最高成像速度接近每秒2000帧，但是由于磁盘的高转速需要通过样品的同一部分多次的每个照明点，因此仪器通常难以达到如此高的速率。用于捕获图像（至少在全帧或半帧大小）的数码相机所需的长集成时间也限制了采集速度。旋转盘显微镜通常使用激光、发光二极管或电弧放光灯照明，但当配备适当波长的固态激光器以匹配荧光团激发峰时，其性能最佳。对于活细胞成像应用，旋转磁盘或其他阵列扫描共聚焦显微镜通常是选择的仪器，特别是当快速细胞动力学正在研究时。平行光束减少光漂白和光毒性，使成像时间更长。

能够以视频速率点扫描标本的其他技术（尽管没有商业化）包括配备声光光束偏转器的仪器(aod；图3(d))，数字镜像可编程阵列(DMD；图4(b))，或旋转多边形镜面（图4(a)）。aod利用超声波波阵面在晶体中产生压力区，该压力区可以衍射或偏转入射激光，角度随声波频率的变化而变化。这些固态器件得益于很少的运动机械部件和可忽略不计的惯性，能够产生几乎瞬时反激的高精度锯齿光栅扫描。此外，AOD扫描仪可以产生用户定义的偏转来生成感兴趣的扫描区域。AOD显微镜的缺点是基于这些设备的色散特性，它只适用于单色光的受控通过。因此，宽带荧光发射不能被解封，通常使用狭缝孔径进行共聚焦检测，导致轴向分辨率降低，并且减少了对来自焦平面外区域的荧光的抑制。此外，为了使激光束的形状与晶体的矩形孔径相匹配，柱面透镜是必要的。虽然这些问题已经在一些实验仪器设计中得到了解决，但使用AOD扫描仪的概念并没有受到显微镜制造商的欢迎。

可编程阵列显微镜（PAMs）的特点是一个数字微镜装置，作为一个空间光调制器在图像平面上产生一个广泛的光谱的用户定义的照明和检测场景。这些仪器在选择能够在反射、透射和荧光模式下工作的光源方面具有很大的通用性，具有光学切片和多个同时感兴趣的区域选择能力。PAM仪器设计的核心是DMD单元，它由微型（约16微米）方形镜面元件组成，可以单独编程以相对于入射光和反射光旋转“开”或“关”（如图4(b)所示）。DMD使重复模式的使用，以增加光吞吐量的多路复用，他们是明显快于在点扫描共聚焦显微镜中使用的振镜。原则上，PAM仪器可以生成可以通过目镜观看的图像和光学切片，荧光发射可以定向到科学级或电子倍增CCD相机系统。使用DMD设备的主要优点是它们可以由软件控制，没有移动部件（除了微型镜子），并且能够使用两个不同的镜子位置来引导光通过单独的光路。在这方面，PAM仪器比旋转盘和狭缝扫描显微镜提供了更多的灵活性。然而，DMD显微镜在照明方面受到严重限制。照明光束必须扩展到覆盖DMD的整个表面，从而减少了任何特定镜面段的可用光量，从而使激光照明源的应用具有挑战性。

图4-共聚焦显微镜的高速扫描设备

旋转多边形反射镜系统的光束偏转是一项成熟的技术，它使用光学简单，非色散表面来创建具有基本锯齿光栅的输出光束，类似于传统的视频扫描。多边形反射镜（图4(a)）已在过去的几个商业和实验共聚焦仪器中使用，但目前尚未由显微镜制造商实施。在实践中，使用多角镜需要相当复杂的光学元件设计，并且这些单位在反射率和角度方面相对于旋转轴容易发生微小的变化。这些角差被称为锥体误差，产生的光束波动必须进行光学校正。由于多边形面的数量必须与栅格扫描线的总数成比例，因此必须经常制造专门的反射镜来构建共聚焦仪器。具有15、25或75个边的多边形必须分别以每分钟63,000、37,800或12,600转的速度旋转，以便产生每秒15,750行的视频速率扫描。这些高速需要专门的轴承，进一步复杂的仪器设计。由于这些原因，基于多边形镜的共聚焦显微镜是罕见的，通常降级到特殊兴趣项目。

与点扫描共聚焦仪器相比，旋转盘、扫描场和线扫描共聚焦系统在光学切片性能方面都存在妥协。较差的性能是由于来自标本偏远区域的光可以通过空间串扰泄漏到检测器中，并且在成像高荧光厚组织标本时变得更加严重。此外，一些商业上可用的旋转盘仪器采用固定的针孔大小，不能由用户调节，因此这些显微镜仅限于与特定物镜放大兼容。这种情况在某种程度上好于市售的基于狭缝的旋转磁盘显微镜，它提供可互换的磁盘来匹配物镜分辨率和放大倍率。然而，上述段落中描述的大多数仪器都牺牲了最佳的衍射限制照明和检测速度，并且无法产生商用激光点扫描共聚焦显微镜上可用的平移或变焦功能。尽管如此，这些显微镜能够以视频速率或更高的速度生成培养中薄的贴壁细胞的优秀图像。

共振扫描仪基础

回顾传统的单点激光扫描共聚焦显微镜，扩展的激光束通过使用振镜镜在样品上扫描，以连续改变光线通过物镜后焦平面的角度。振镜被战略性地放置在彼此90度角，使扫描镜的旋转轴与它们自己的表面以及显微镜的光轴在远心平面上重合（与物镜后焦平面共轭）。前后旋转的振镜镜翻译聚焦的激光光斑在一个光栅图案，穿过横向尺寸的领域横跨试样。一面镜子(x)的左右旋转产生水平扫描线，而另一面镜子(y)的上下旋转产生垂直偏转。现代共聚焦仪器配备了先进的扫描系统，赋予高度的灵活性，以形状和尺寸的标本区域被扫描。扫描角度可以通过重新分配x振镜信号的一部分到y振镜来旋转，反之亦然。同样，共焦变焦功能可以通过改变振镜的角度扫描范围来实现。扫描一个专门的用户定义的区域的标本的能力是特别有用的实验，需要光激活或光漂白选定的区域，不具有矩形几何形状。

用于激光扫描显微镜的高性能伺服控制闭环振镜是一项工程奇迹，它可以精确地旋转附着的反射镜，并在超过数十亿个周期的使用寿命内以极高的精度定位光束。振镜的构造方式类似于电动机，使用转子和定子来驱动定位致动器的运动，定位致动器包含整个组件，并根据其扭矩-惯性比做出响应。根据振镜的设计，转子或定子是一个永久的磁性，与姐妹组件的线圈相互作用，产生驱动转子的力。机械止动器用于将转子运动限制在有限的旋转弧度内。在大多数共聚焦显微镜中，由于其紧凑的尺寸，高定位精度，优越的刚度和快速响应，移动磁铁驱动器是首选。振镜镜表面是一层银或铝薄膜，沉积在硅、熔融石英或铍衬底上。振镜最重要的要求之一是它们重量轻，由刚性材料制成，孔径大小不限制光进入物镜孔径，并且具有高度抛光的表面，其表面平坦到波长的一小部分。反射镜必须在较宽的波长范围内（大约350到700纳米）具有相同的反射性，并且反射面应以扫描单元的旋转轴为中心。

图5-谐振电流计镜扫描运动

如上所述，由于惯性，伺服控制线性振镜的扫描速度受到限制，因此，在标准帧尺寸下，只能以图像采集速率对样品进行光栅扫描，通常范围为每秒1至5张图像。为了实现视频速率，用于水平线扫描的较慢的线性振镜可以用更快的共振扫描振镜代替，该振镜以固定频率振动，相当于音叉的旋转。在谐振振镜(也称为逆旋转扫描仪；CRS)，存储在扭转弹簧或杆组件中的能量用于以正弦波方式振荡反射镜。这些设备以4到8千赫兹的共振频率循环，通常接近国家电视系统委员会（NTSC）视频标准每秒15750线的水平频率的比例部分。当一个工作频率为7900赫兹的共振扫描仪被用来获取512条线，这些线以双向方向逐步扫描（奇数线从左到右，偶数线从右到左），结果是单个线周期约为125微秒，图像捕获率为每秒30帧。

图5中展示了几种具有不同反射镜孔径的谐振振镜设计（图5(a)），以及说明反射镜振荡运动的示意图（图5(b)）。高速（7.9千赫兹）谐振振镜可以围绕中心轴在每个方向上旋转约12度。入射激光激发光从镜面以物理镜面位置决定的角度反射（覆盖总范围为24度）。如果根据振荡周期的相位和速度来考虑镜像运动，则镜像从相位为-2π（速度等于零）通过0（最大速度）过渡到+2π（速度等于零）。因此，正如下面将更详细描述的那样，在振荡周期的末端，镜面达到其最大角度时，速度最小（或为零），而在周期的中心，镜面角度为零时，速度最大。

谐振振镜扫描仪的主要优点之一是，它们在振荡周期中逐渐加速和减速，从而避免了在每个扫描线开始时需要复位信号。为了实现平滑运动，先进的扫描仪配备了两个振荡的质量平衡扭转杆，它们经过机械调谐，在相反的相位共振，以建立相等但相反的扭矩，在外壳附着位置抵消。结果是一个无反应的机械振荡器，消除了摆动和外部振动。高速共振扫描仪上的反射镜孔径直径约为5毫米，采用镀银或镀铝的光学级铍制成，具有优异的刚度重量比。这些振镜的扫描角度范围从15到26度，峰对峰。在振荡过程中，如图5(b)和图6所示，谐振振镜的角速度以余弦曲线的方式变化，在扫描角为0度时（扫描场中心）达到最大速度，在扫描角为90度时（扫描场边缘）达到最小速度，此时扫描方向发生变化。当使用共振扫描仪生成图像时，这些非线性变化在像素时钟方面提出了一个重大问题。

共振扫描器时钟问题

由于共振扫描速度的非线性，荧光样品在中心区域以最高速度扫描，随着扫描到达边缘，速度逐渐降低。因此，当从共振扫描仪中获得的图像数据流用一个帧捕获器以恒定的像素率（假设波束被线性扫描）进行采集时，图像在边缘出现拉伸。此外，激光激发强度的不均匀分布（在边缘更大）在扫描区域的边缘产生过度的光漂白（和潜在的光毒性），因为增加了暴露于激光。补偿扫描非线性的最简单的选择是将扫描范围限制在振镜速度几乎是线性的振荡周期的那一部分，这发生在跨越大约70%的总扫描宽度的区域。不幸的是，这种解决方案减少了可以收集发射信号的时间，增加了再次收集信号之前的扫描周转时间，并且不能防止标本落在被记录区域之外的区域的光漂白。光漂白效应可以最小化，然而，当使用的振镜振荡的线性部分，结合可调的孔径，限制了该地区的试样被暴露在照明。

幸运的是，非线性谐振振镜扫描引起的图像畸变是可预测的，并且可以使用软件或硬件解决方案进行校正。无论产生图像的校正方案如何，最有效的扫描策略包括在振镜的前向和后向扫描期间收集数据。在正向扫描期间记录数据是直接的，但由于向后扫描颠倒了记录像素的方向，因此必须使用专门的读写缓冲区或软件反转图像数据。在实践中，图像以正常宽度的两倍（实际上，最终图像大小为512 x 512像素，为1024像素）和正常高度的一半（256像素）收集。在谐振振镜的每个正向x轴扫描结束时，提供给线性(y)振镜的垂直锯齿信号增加一条线，并开始反向(x)扫描。以这种方式，垂直扫描顺利进行256个周期，直到获得一张图像的足够数据。

图6-具有线性像素时钟的共振扫描共聚焦图像

谐振扫描共聚焦显微镜的软件和硬件时钟解决方案都依赖于知道高频谐振振镜的位置数据。在7.9千赫兹的设备上，这个镜子可以围绕中心轴在每个方向上旋转大约12度（总共旋转24度）。反射镜的角度位置（θ）和相位或速度（φ）的关系可以根据振荡周期的状态来预测。在振荡周期的开始(镜面位置等于正负12度；（见图5和图6），镜子是静止的，速度等于零。当反射镜向中点摆动时，角速度随相位的余弦函数而增加，并在反射镜角度为零时达到最大值。接着，当它接近正向扫描的终点时，镜子再次减速，直到它在瞬间逆转方向时达到等于零的速度。当镜子向相反方向旋转时，可以观察到角速度的相同变化。谐振振镜应该考虑的另一个因素是，这些器件是高q振荡器，即使在自然振镜频率与外部驱动源之间发生最轻微的漂移时，由于相位和幅度的响应变化很大，因此无法有效地同步到外部频率。因此，谐振振镜本身应用作主振荡器，使所有其他定时元件同步。

共振扫描共聚焦显微镜的基于软件的时钟方案涉及算法，该算法能够使用基于可预测的镜子运动的查找表对像素数据进行线性化。例如，一种流行的算法首先确定镜像和帧捕获器的相位常数，然后定位最终图像的中心像素。该算法围绕对称的中心平面运行，在中心平面上，可以高精度地知道镜子的位置。当图像被传送到帧捕获器时，通过一次检查一条水平扫描线来处理图像。从扫描仪接收的像素数据以最终图像宽度的两倍和最终高度的一半存储。该过程的第一步涉及从水平扫描线的后半部分反转数据点，然后将反转数据在图像的前半部分的数据线之间隔行（图6(b)）。由于数据收集和触发采集的水平同步信号启动之间的滞后，图像的中点可能无法确定，因此通常需要软件将反转扫描线偏移几个像素。在这种情况下，扫描线的右边缘可以作为图像的参考点。该序列的下一步是对每个像素或相对于中心像素的相位位置应用校正因子。然后将该像素重新定位到最终图像中的正确位置（图6(c)）。在理想的情况下，使用先进的高速计算机，传入的数据可以在飞行中进行分析，并实时记录到硬盘驱动器中。

硬件时钟

由于谐振振镜会随着温度和振幅的变化而漂移，并且是其他难以控制的变量的宿主，因此设计硬件时钟机制的关键是精确确定扫描镜在整个振荡周期内的瞬时角位置。目标是每当激光束在正向扫描时从左到右或在反向扫描时从右到左穿越均匀间隔的像素边界时产生时钟脉冲。这些时钟脉冲在谐振振镜的时间上不会均匀间隔。如上所述，这种差异的发生是因为角速度在扫描范围的中心是最大的，在那里时钟脉冲会更频繁（大约有70纳秒的间隔）。在极端情况下，当振镜开始改变方向时，时钟脉冲将具有更大的间隔（接近160纳秒）。在理想的情况下，时钟脉冲被用来触发光电倍增管输出的模数转换，每个像素将在最终图像中代表一个相等的空间位移。已经开发了几种方法来使用硬件对谐振扫描数据进行线性化（称为扫描线性化），但最成功的两种策略是模拟像素时钟和实时测量反射镜位置的光栅。

像素时钟解决方案的一个例子是利用电压控制振荡器（VCO）和相位检测器连续跟踪振镜的像素到像素和周期到周期的操作。一旦像素时钟锁定在扫描仪谐振频率上，振荡器就会向计数器计时，计数器访问存储像素位置与扫描速度相关信息的存储芯片。存储器将存储的信息通过数模转换器发送，该转换器在闭环中馈送给压控振荡器。VCO接收的控制电压用于校正时钟频率，以匹配扫描仪余弦速度的变化。作为交叉检查，像素时钟向相位检测器发送每个像素触发器的信号，相位检测器将时序与扫描仪同步电子器件进行比较。检测到的相位误差产生一个校正电压，该电压反馈到VCO，以保持与扫描仪的周期同步。VCO输出用于在检测器处对像素进行时钟处理。谐振振镜制造商提供了几种先进的专有像素时钟，作为其控制电子设备的选择。然而，大多数生成的信号都是基于查找表的，并且不允许由于机械漂移而导致的扫描模式的小变化。

图7-共振扫描共聚焦显微镜像素时钟架构

最先进的基于硬件的像素时钟能够在整个扫描周期中直接跟踪镜子的位置，使用直接跟踪镜子运动的辅助反馈系统获得的光学数据。也许最好的例子是由Roger Tsien和Brian Bacskai首先描述的，并作为20世纪90年代初推出的第一台商用共聚焦显微镜的基础，该显微镜包含一个共振扫描仪，尼康RCM-8000。目前，高性能的尼康A1R共聚焦显微镜系统采用了类似的时钟系统。简而言之，尼康像素时钟是基于使用一个辅助的低功率红外激光系统来反射来自谐振振镜的反向镜面的定时光束。反射光束聚焦在一个透明和不透明条纹的光栅上（称为Ronchi光栅），并沿着光栅与共振扫描器周期同步振荡。通过光栅的光被记录为强度变化，使用专用的光电二极管将信息提供给数字化图像数据的电子元件。由于振镜镜的位置在其振荡时被高精度地检测到，因此像素时钟非常准确。

如图7所示是一个示意图，概述了谐振扫描共聚焦显微镜中基于Ronchi光栅的可变像素时钟的光学列车的组成部分。像素时钟的主要光学和电子元件如图左侧所示，包括一个低功率半导体近红外激光源，一个包含不同间距Ronchi光栅的可旋转磁盘，将反射的激光束聚焦到Ronchi光栅上的中间透镜，以及一个检测通过光栅的光脉冲的光电二极管传感器。参与激发和成像光学序列的组件呈现在图的右侧，但为了简单起见，将成像组件的数量减少到最小。请注意，附在图7中的谐振振镜的镜子有两面高反射表面，以适应成像和时钟激光。

在工作中，时钟二极管激光器发出的光被定向到谐振扫描镜的反射背面，而涉及成像系统的激光器发出的光从同一镜子的正面反射。时钟激光器的反射光被一个聚光透镜聚焦，随着振镜的振荡运动同步扫过Ronchi光栅的表面。在光栅处，激光束被扫描穿过一系列交替的不透明线和等宽的透明空间。冷凝透镜将时钟光束聚焦到比光栅中的线间距小的尺寸，以确保光完全通过或部分被光栅阻挡，以依赖于振镜位置的交替方式。为了消除衍射，一个关键点是激光光斑在光栅表面水平应明显小于光栅线宽。由振荡振镜引起的光强波动由光电二极管检测，光电二极管位于光栅的正下方。

在谐振振镜的水平扫描期间，时钟光电二极管记录由Ronchi光栅散射的激光脉冲，该脉冲可被电子转换为具有可变频率的像素时钟。当振镜处于其振荡周期的中心部分时，这些光脉冲将更频繁，但当镜到达扫描结束并反转方向时，它们将减慢。光电二极管检测器的要求之一是能够处理可变脉冲频率（就带宽而言），并且它必须足够大以检测整个线路扫描。探测器连接到一个跨导放大器，该放大器将光电二极管电流脉冲转换为放大电压，然后将其馈送到倍频电路，使每行像素数加倍。光电二极管和相关的电子器件每条线路传送256个脉冲，倍频电路将该输出转换为每条线路512个脉冲，这些脉冲由帧捕获器获取并用于构建图像。

图8-基于Ronchi光栅的谐振扫描像素时钟

图8展示了使用龙氏光栅耦合到光电二极管检测器作为可变像素时钟的基本概念。为了清晰起见，图8(a)中所示的光栅只包含八个等宽的间隔，叠加一个谐振振镜随时间的完整余弦运动周期(红色曲线；125微秒)。实际的光栅有256行间距，并且在线性尺寸上更加紧凑，因为像素时钟激光器实际上在运行中沿着光栅表面回溯一条单线（垂直于不透明线）（图8(b)）。当光束进入和离开Ronchi光栅的透明区域时，光电二极管检测到的透射光强度随着振镜的运动而上升和下降（图8(c)）。光电二极管检测到的光强度的每次转换（在这种情况下，从暗到亮）用于生成触发显微镜图像捕获的像素时钟（图8(d)）。尽管图8(d)中所示的时钟脉冲在时间上的间隔是非均匀的（范围从大约70到160纳秒），但它们在图像空间中对应于相等的间隔。

为了在相同的空间间隔（而不是在相同的时间增量）获取像素样本，光电倍增管信号从主显微镜成像系统通过具有可变增益和偏移的传统放大器，然后由一个模拟-数字转换器由龙池光栅脉冲产生的像素时钟触发数字化。然而，由于谐振振镜在两个方向上扫描，一半的图像信息被反转。为了在构建图像之前纠正这种双向扫描伪影，数字像素输出首先传输到先进先出（FIFO）或后进先出（LIFO），缓冲区取决于像素是从左到右还是从右到左获取。因此，在振镜的水平扫描期间，在扫描的前半段（62.5微秒的时间段）获得的图像像素被馈送到FIFO缓冲区，而在反向扫描期间获得的像素被馈送到LIFO缓冲区。FIFO缓冲区在每次水平线采集开始时被读取并重置为零，而LIFO缓冲区在传入数据存储期间向上计数，在随后的读出期间向下计数，以确保在反向扫描期间获得的像素被反转。

共振扫描的优点

与旋转圆盘、扫描场和旋转多边形显微镜不同，共振扫描激光共聚焦显微镜能够在不改变物镜的情况下改变放大倍率，通过使用通用的共聚焦变焦功能。变焦控制的物理基础包括改变水平谐振振镜扫描镜和垂直线性振镜的旋转角度。较小的扫描角减少了被扫描试样的面积，同时保持相同数量的像素，以有效地提供所选试样细节的放大图像。调用共焦变焦功能需要改变用于可变像素时钟的Ronchi光栅中线的间距。图7中的磁盘包含四种尺寸的Ronchi光栅，每个光栅都可以旋转到像素时钟光学序列中，以改变缩放系数。当龙氏光栅中的线尺寸和间距尺寸减少一半（保持相同的总线数）时，变焦系数增加两倍。同样，减少光栅线尺寸尺寸的四倍增加变焦系数到4倍。可能的缩放设置的数量取决于可用于可变像素时钟的Ronchi光栅尺寸的数量。尼康A1R激光共聚焦显微镜能够从1倍到8倍的7个变焦步骤。交换光栅需要减少谐振振镜的扫描角，这是使用预先存储的信息在显微镜控制电子，协调振镜扫描角与选定的光栅完成。

共振扫描振镜动力学为成像采集速率提供了广泛的选择余地，只需改变所获取图像的尺寸，这与旋转磁盘显微镜中区域阵列探测器的像素分割非常相似。虽然水平线的扫描速率是由振镜的谐振周期固定的，但可以减少每个图像使用的线的数量以产生更快的成像速率。因此，在图像尺寸为512 x 512像素时，尼康A1R显微镜以每秒30帧的速度产生图像。如果收集一半的垂直线来获得尺寸为512 x 256像素的图像，那么理论上帧速率将增加一倍，达到每秒60帧。请注意，由于在较高的速度下线性(y)振镜重新定位的轻微延迟，图像尺寸与速度的关系并不完全是线性的。对于尼康A1R显微镜，在共振扫描模式下可实现的最高扫描速率为每秒420帧，图像尺寸为512 x 32像素。对于许多应用，例如活细胞中的快速钙波成像，降低垂直图像尺寸是可以接受的牺牲，以增加速度。

图9-串联检流计在共振扫描共聚焦显微镜中的应用

图9所示的是在活细胞中使用光学荧光蛋白的光转换和光激活实验，这明显受益于串联扫描和高速能力的组合，因此配备共振扫描共聚焦显微镜。图9(a)至9(c)显示了mEos2（一种红到绿色的可光转换荧光蛋白）与连接蛋白43缝隙连接组分融合标记的缝隙连接中的光转换，并在活的HeLa细胞中表达。选择一小块区域，用耦合到405纳米激光器的线振镜进行光转换（图9(A)），然后用488纳米激光器进行成像(图9（b)和9(c)）。图9(d)至9(f)显示了肾细胞中PA-GFP与人β -肌动蛋白融合的光活化。与图9(a)相似，感兴趣的区域用405纳米激光照射，然后在488纳米处成像。最后，利用红光点燃荧光蛋白（KFP1）与线粒体靶向信号融合实现线粒体的光开关，如图9(g)至9(i)所示。用561纳米激光在荧光和差分干涉对比（DIC）模式下对标记的线粒体进行成像，如图9(g)。在488纳米光照下将标记嵌合体完全“关闭”后，线粒体似乎没有荧光（图9(h)），可以通过再次在561纳米下成像重新激活（图9(i)）。使用光学荧光笔的研究可以用共振扫描共聚焦显微镜进行，成像速度必要，以阐明各种时间尺度上的细胞内动力学。

这些成像技术是由尼康A1R扫描仪中的超选择器实现的（见图1），它将用于光激活的405纳米光子转移到振镜扫描仪，使共振扫描仪自由地同时获得光激活产物的高速图像。振镜扫描仪可以放大以限制刺激区域的大小（这可以显着加速光激活）。在405纳米光激活，同时使用共振扫描仪获取图像的能力扩展到尼康A1R-MP多光子显微镜。

总结

传统的激光扫描共聚焦显微镜的主要缺点是图像采集速度相对较慢，尽管它们具有高分辨率和从焦平面移除的荧光区域产生的光的排斥优势。共聚焦技术的主要技术限制是需要一个快速的水平（x轴）扫描镜，能够实时每帧产生500或更多行。然而，即使在那些配备标准线性振镜的点扫描共聚焦显微镜的相当慢的扫描速率下，构成单个像素的光束停留时间非常短，并且限制了可以收集的信号量。随着提高共聚焦扫描速度的新技术的引入，比如共振振镜，继续提高点扫描共聚焦显微镜的速度只会导致信号量的减少，直到最终在最高速度下耗尽。这种压倒一切的关键任务信号噪声概念可能不公地导致了几种替代高速成像技术的发展，这些技术的光学切片性能较差，而代价是将工程精力集中在能够视频速率图像捕获的点扫描仪器上。

与预期相反，一些报道表明，配备共振扫描仪的高速点扫描共聚焦显微镜可能既能提高信号水平，又能减少预期的光漂白。这一意想不到的结果很可能源于合成荧光团、量子点和遗传编码荧光蛋白极其复杂的光物理行为，所有这些似乎都能够通过广泛的尚未解释的机制在不同程度上进行光激活、光转换和光开关。关于共振扫描共聚焦显微镜，增加的荧光信号可能产生于激发照明剂量依赖的响应，该响应由快速扫描调制以产生增加的信号水平。通常，这样的响应应该取决于聚焦激光光斑的直径和光束扫描样品的速度。结果模拟了荧光团的脉冲照明。由于脉冲照明可以将荧光团转变为黑暗或“关闭”光开关状态，从而避免进入三重态，因此荧光发射水平增加，而光漂白率有所降低。这些报告尚未得到广泛的实验验证，但在检查活体和固定标本的快速共聚焦成像结果时，应牢记这些报告。

共振扫描共聚焦显微镜，一种仍在发展和完善的技术，应该被证明是一种有用的方法，用于检查大量的生物问题，使用细胞，组织和完整的生物体，在视频速率成像对实验至关重要的条件下。能够同时利用共振和线性振镜进行高速成像串联特定区域感兴趣的光激活或光漂白在优越的光学切片分辨率是一个额外的好处，不能轻易实现与其他技术。最复杂的仪器能够结合视频速率共聚焦扫描与光谱成像使用专门的探测器，以进一步提高这些显微镜的效用。例如，使用荧光蛋白FRET生物传感器成像钙波需要非常快的采集速度，因为波可以在不到一秒的时间内穿过细胞。使用传统的共聚焦显微镜，钙成像几乎是不可能的，但有了像尼康A1R这样的仪器，可以实时捕获波，并且可以用光谱探测器解开两个荧光团对FRET发射光谱的贡献。这种类型的实验，以及无数其他的，将在未来受益于共振扫描激光共聚焦显微镜的检查。