BioRxiv * 新型头戴式体积成像双光子显微镜-低成本，易组装，高分辨，大视野
BioRxiv
High-throughput TWo-photon volumetric brain imaging in freely moving mice
2024.10.14
第一作者 Long Qian 和 Yaling Liu
通讯作者 Jianglai Wu
通讯作者单位 北京脑科学研究所，中国医学科学院 & 北京协和医学院
新型自由活动小鼠头戴式高通量
双光子体积成像显微镜
文章介绍了一种新型的高通量微型Bessel光束双光子显微镜（miniBB2p），它能够在自由活动的小鼠中，对420 × 420 × 80 μm³体积内的神经元和树突进行亚细胞分辨率的成像。这项技术的发展是为了克服现有微型多光子显微镜在快速体积成像、脑组织运动敏感性以及全场深分辨率方面的限制。研究团队提出了一种创新的光学设计，利用Bessel光束的独特特性，以提高成像的速度和深度，同时减少数据量。这种新型显微镜的设计思路是将2D扫描速率转化为体积成像速率，从而提高信息量，并使成像对脑组织的轴向运动具有抵抗力，这对于监测自由移动动物的神经回路是非常理想的。此外，Bessel光束2PM在相同的激发数值孔径下比高斯光束2PM具有更好的横向分辨率，并且对光学像差如球差不敏感，这表明可以为微型显微镜设计更简单的镜头。
Figure 1: miniBB2p的设计和测试
a: 展示了佩戴显微镜头件的小鼠照片。
b: 展示了在LMA-12光纤尖端的定制微轴锥的光场显微图和在光纤尖端约5mm处成像的环状图案。
c: 示意图展示了miniBB2p的关键元件和激发光束路径。
d: 对比了使用Bessel焦点和高斯焦点进行体积成像所需的2D扫描次数。
e: 使用500nm荧光珠测量的横向和轴向点扩散函数。
f: 使用miniBB2p成像的Thy1-GFP-M小鼠脑切片的图像，以及使用台式高斯光束2PM从同一体积收集的3μm步长的图像堆栈。
g: 图f中框选区域的放大成像；白色箭头指出了Bessel焦点更清晰地可视化的树突棘。
h-j: 使用miniBB2p在自由移动的小鼠中成像前扣带皮层（ACC）中神经元的自发活动，展示了1015个神经元的空间分布和示例钙信号。
k-l: 在清醒固定的小鼠中使用台式2PM对同一体积进行成像，展示了不同层的神经活动成像。
Figure 2: miniBB2p的应用演示
a-f: 在次级运动皮层（M2）中的记录，展示了在自由探索行为场的小鼠中，跑步增加了大多数神经元的平均ΔF/F，跑步调制指数（MI）显示了跑步期间活动增加。
g-l: 在ACC中的记录，展示了在自由移动的小鼠中，对疼痛刺激范式下ACC的神经活动，以及在给予周围刺激前后ACC中神经元的Ca2+活动。
Supplementary Fig. 1: miniBB2p的设计和脉冲传递测试
a: 展示了miniBB2p的概览以及其头件的光学布局。
b: 使用不同功率通过1米LMA-12光纤后的920纳米激光脉冲宽度的自相关轨迹图。
c: 展示了带有定制轴锥尖端的光子晶体光纤LMA-12的原理图。
Supplementary Fig. 2: miniBB2p中的激发光学
a: 展示了从MEMS镜子到焦平面的激发光束路径的展开图。
b: 展示了透镜的塞德尔像差系数。
c: 展示了在Ø 600 μm视场范围内的均方根波前误差。
d: 展示了显微镜的畸变情况，最大畸变约为-2.1%。
Supplementary Fig. 3: 使用高斯光束和Bessel光束激发的miniBB2p模拟
a: 在焦平面上的高斯焦点。
b: 在焦平面上的Bessel焦点。
c 和 d: 分别展示了使用高斯光束和Bessel光束激发时的横向点扩散函数（PSF），比较了它们在视场中心和边缘的性能。
Supplementary Fig. 4: miniBB2p中的荧光收集和畸变校正
a: 展示了从焦平面到探测器的光线路径。
b: 展示了不同位置的荧光被硅光电倍增管检测到的情况。
c 和 d: 使用荧光塑料滑块测试了场均匀性，并展示了校正前后的亮场图像。
Supplementary Fig. 5: miniBB2p中的横向和轴向分辨率
展示了在视场中心、边缘和角落处的点扩散函数（PSF），并评估了分辨率。
Supplementary Fig. 6: miniBB2p对小鼠运动影响最小
展示了佩戴和未佩戴假负载的小鼠运动轨迹，以及在两种条件下小鼠运动的累积距离、速度分布和进入中央区域的次数。
Supplementary Fig. 7: miniBB2p成像的稳定性
展示了在不同天对ACC同一视场进行成像的结果，以及在多次记录中匹配的细胞示例。
Supplementary Fig. 8: 在头部固定的清醒Thy1-GFP小鼠大脑中成像树突和棘
展示了使用miniBB2p和台式高斯光束2PM在ACC中成像的树突和棘的图像。
Supplementary Fig. 9: 使用miniBB2p在表达GCaMP8s的小鼠大脑中成像树突和棘的活动。
展示了在头部固定的清醒小鼠和自由移动小鼠的ACC中成像的树突和棘的活动。
Supplementary Fig. 10: 抑制S1输入增强了ACC中的痛觉反应
展示了在给予CNO注射前后使用miniBB2p在ACC中成像的结果，以及相应神经元的ΔF/F轨迹。
Supplementary Table 1: 当前最先进微型多光子显微镜的光学性能
列出了不同研究中使用的微型多光子显微镜的主要参数，包括收集和激发的数值孔径、横向和轴向分辨率、视场大小和帧率。
Supplementary Table 2: miniBB2p成像的主要参数
列出了在不同实验设置下使用miniBB2p进行成像的主要参数，包括成像范式、视场大小、帧率、成像持续时间、3D数据投影、激光功率等。
Supplementary Table 3: miniBB2p头件的成本
列出了构成miniBB2p头件的关键组件的成本，包括透镜、探测器、光纤等，并计算了总成本。
Summary
这篇文章报道了一种革命性的微型双光子显微镜——miniBB2p，它能够实现在自由移动的小鼠中对超过1000个神经元进行高分辨率和高通量的体积钙成像。这种新型显微镜以其轻巧的重量、减少的牵引压力、简单的光学设计和最大化的荧光收集效率，允许在不妨碍动物行为的情况下进行长期稳定的成像。研究团队通过在小鼠的不同脑区进行成像，展示了miniBB2p在神经活动成像中的应用，包括对运动皮层中神经元的响应、疼痛刺激下ACC神经元的活动变化，以及在化学遗传学抑制下ACC中神经元的反应。这些结果不仅证明了miniBB2p在神经科学研究中的潜力，也为未来在更广泛的领域中应用头戴式多光子显微镜提供了可能。此外，文章还强调了这种显微镜的成本效益，其光学设计和成本控制的方法有望推动微型多光子显微镜技术的发展。
脑科学研究需要工具。光学成像技术具有高分辨率、高通量、非入侵等优势，是脑科学研究的重要手段。我们实验室致力于发展新型脑功能光学成像技术，主要包括：大视场高分辨兼备的高通量双光子显微技术，用于基因编码类电压指示剂功能成像的超快双光子显微技术，高通量光片荧光显微技术。期望通过发展这些新型光学成像技术，为脑科学研究提供新的技术和思路。
北京脑科学与类脑研究所 (cibr.ac.cn)
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