bioRxiv preprint * Opto2P-FCM：新型头戴式微型双光子光遗传显微镜
bioRxiv preprint
Opto2P-FCM: A MEMS based miniature TWo-photon microscope with two-photon patterned optogenetic stimulation
2024.10.21
第一作者 Gregory L. Futia, Mo Zohrabi, Connor McCullough
通讯作者 Emily A. Gibson
通讯作者单位 University of Colorado Anschutz Medical Campus, Department of Bioengineering, Aurora, CO 80045, USA
Opto2P-FCM：一种基于MEMS的微型双光子显微镜
具有双光子模式光遗传刺激功能
本文介绍了一种新型的微型双光子显微镜——Opto2P-FCM，它结合了先进的成像技术和光遗传学刺激手段，旨在神经科学领域实现对活体动物脑部活动的精确控制与观察。
传统的双光子显微镜在分辨率和成像深度上具有显著优势，但其体积庞大，限制了在自由移动动物中的应用。此外，光遗传学技术的发展为精确操控特定神经元活动提供了可能，但其与高分辨率成像技术的结合一直是个挑战。Opto2P-FCM的开发旨在突破这些限制，通过微型化设计和集成光遗传学刺激，实现在自由移动动物中的高分辨率脑部成像和精确操控。
研究团队通过精心设计的MEMS扫描器和特定的光学配置，使Opto2P-FCM能够在保持高分辨率的同时，实现对神经元的模式化光刺激。这种设计不仅减轻了设备的重量，降低了复杂性，还提高了系统的灵活性和实用性。通过在自由移动的小鼠中进行的实验，研究团队展示了Opto2P-FCM在活体动物中进行细胞特异性操控和高分辨率成像的能力。
Figure 1 展示了Opto2P-FCM微型双光子显微镜的设计和功能。这个装置由几个关键部分组成：
图(a)：展示了激光器和检测系统的示意图。920 nm脉冲激光通过偏振保持光纤（PM780）进行光谱展宽，并通过传输光栅对压缩器进行色散补偿。1030 nm脉冲激光通过空间光调制器（SLM）进行全息空间图案化，然后通过相干成像光纤束（CFB）传递到显微镜的第二光路。荧光通过同一CFB收集，并通过二色镜分离后由光电倍增管（PMTs）检测。
图(b)：展示了微型显微镜的详细布局和光路图。920 nm激光输出从PMF准直并从MEMS扫描器反射，通过由平凸透镜和消色差透镜组成的扫描透镜产生成像平面上的远程中心扫描。1030 nm的图案化光刺激光从CFB出射，使用非球面透镜准直，通过二色镜与920 nm光结合，并聚焦通过同一物镜。微型物镜设计的工作距离为1.5 mm，使920 nm和1030 nm光聚焦到同一成像平面。
图(c)：展示了在自由移动小鼠中进行头部附着的双光子成像和选择性光遗传双光子光刺激的体内演示。成像是在视觉皮层进行的，神经元共表达钙指示剂jGCaMP7s和光感受器ChRmine。对成像视野中的三个感兴趣区域（ROI）进行双光子光刺激。获取了图像时间序列，其中所有三个ROI同时被照亮，然后是每个单独的ROI依次被照亮。jGCaMP7s的ΔF/F迹线显示了与光刺激同步的ROI中的响应。
图(d)：展示了Opto2P-FCM的分辨率，可以从小鼠体感皮层表达jGCaMP7s的神经元中可视化细胞过程。
Figure 2 展示了Opto2P-FCM的光学性能，包括图像分辨率和视场测量：
图(a)：通过测量920 nm激光焦点处均匀平坦荧光靶标的双光子荧光信号来表征Opto2P-FCM的轴向分辨率。与具有10x/0.4 NA物镜的台式双光子显微镜相比，Opto2P-FCM的全宽半高（FWHM）为14 µm，而台式显微镜为11 µm。
图(b) 和 图(c)：通过测量两种不同光刺激图案（20 µm和40 µm直径圆）的双光子荧光强度与轴向位置的关系，来测量1030 nm光刺激的轴向分辨率。FWHM分别约为50 µm和54 µm。
图(d)：展示了Opto2P-FCM拍摄的50 µm网格幻灯片的图像，显示了约200 µm × 300 µm的视场。
图(e)：展示了Opto2P-FCM焦点处的光刺激图案（4个20 µm直径的圆圈）的图像，通过从薄罗丹明样品的双光子荧光记录。
Figure 3 展示了在自由移动小鼠中进行细胞特异性双光子模式光刺激和同时双光子成像的演示。刺激序列包括所有ROI一起刺激，然后是每个ROI单独刺激。顶部面板使用0.5 m长度的CFB在视觉皮层进行，底部面板使用1 m长度的CFB在体感皮层进行：
图(a) 和 图(d)：展示了刺激和检测的领域和ROIs，实线圆圈ROIs表示目标刺激区域，虚线ROIs表示CaImAn检测到的区域。
图(b) 和 图(e)：展示了记录时间序列期间jGCaMP7s活性的ΔF/F迹线，颜色与(a)和(d)中的ROIs匹配。实线表示CaImAn的ΔF/F去噪迹线，虚线表示刺激ROI的原始ΔF/F迹线。底部的颜色匹配条表示刺激时间和持续时间，黑色代表所有ROI的刺激。
图(c) 和 图(f)：展示了小鼠在记录过程中的静止帧。行为视频显示在视频S1中。
Figure 4 展示了Opto2P-FCM成像场的可重复性，展示了在不同天数重复成像相同细胞领域的例子：
图(a) 和 图(b)：展示了在视觉皮层和体感皮层中，通过将Opto2P-FCM头部附着在移动动物上，重复访问相同的细胞领域。彩色箭头指示了几个参考特征。
Table 1: Opto2P-FCM Components这张表格列出了构成Opto2P-FCM的各个部件，包括部件编号、项目编号、描述和供应商信息。这些部件包括各种透镜（如非球面透镜、平面凸透镜、消色差透镜）、二色镜、MEMS扫描器、光纤和光纤束。这些部件的组合使得Opto2P-FCM能够实现高分辨率的双光子成像和光遗传刺激。例如，部件1和5是非球面准直透镜，部件2和7是平面凸透镜，部件3和4是消色差透镜，部件6和8是中继透镜，部件9是二色镜，部件10和11是物镜，部件12是非球面透镜。MEMS扫描器负责扫描光束，而光纤则负责传递920 nm的激发光，光纤束则负责传递1030 nm的光刺激光并收集发射的荧光光。
Table 2: Laser Specifications这张表格提供了两种激光器的规格。第一种是SpectraPhysics Mai Tai HP DeepSee激光器，用于双光子激光扫描显微镜，波长为920 nm，脉冲持续时间为80飞秒，重复率为80 MHz，最大输出功率为1.85 W。第二种是NKT Photonics aeroPULSE SF50激光器，用于双光子光刺激，波长为1030 nm，脉冲持续时间为400飞秒，重复率为2 MHz，最大输出功率为50 W。这两种激光器的结合使得Opto2P-FCM能够进行高效的双光子成像和光刺激。
Figure S1: Optical Design, Assembly, and Performance Simulation in Zemax这张附图展示了Opto2P-FCM的光学设计、组装和在Zemax中的性能模拟。
图(a)展示了Opto2P-FCM的光学布局和光线追踪，包括不同扫描角度下的光线路径。光学设计包括通过偏振保持光纤传递的920 nm激发光，1030 nm的光刺激，以及通过相干光纤束进行的收集。
图(b)展示了组装好的设备在3D打印的外壳中的照片。图(c)展示了设备的最小和最大工作距离。
Figure S2: Simulations of the Opto2P-FCM Point-Spread Function这张附图展示了Opto2P-FCM点扩散函数的模拟。
图(a)展示了在不同扫描角度下920 nm激发光的点扩散函数，显示了聚焦点在所有扫描角度下都在艾里衍射盘半径内，表明了衍射极限性能。
图(b)展示了1030 nm光在成像平面上的点扩散函数，显示了在不同输入光束位置下的聚焦点。
图(c)展示了激发光和光刺激光的聚焦点的均方根半径随工作距离变化的图表。
图(d)展示了激发光的斯特列尔比随MEMS扫描器的扫描角度和工作距离变化的密度图。
Figure S3: Inspection Scope Used for Optical Characterization and Spatial Calibration这张附图展示了用于光学特性和空间校准的检查镜的示意图。
图(a)展示了检查镜的布局，包括10x/.4 NA Olympus物镜、反射镜、滤光片、100 mm焦距的镜头和相机。
图(b)展示了检查镜、样品架和Opto2P-FCM的照片。
Figure S4: Setup for Pulse Characterization and Pulse Measurements这张附图展示了脉冲特性和脉冲测量的设置。
图(a)展示了从Opto2P-FCM输出的激光通过40x/.5 NA反射物镜收集，并通过5:95分光器传递到光谱分辨自相关器。
图(b)展示了920 nm激光输出的频率分辨光学门控（FROG）光谱图。
图(c)和(d)展示了重建的脉冲时序和光谱轮廓，测量得到的脉冲持续时间为约130飞秒，带宽为约8纳米。
Figure S5: Opto2P-FCM Two-Color Imaging at Depth in the Visual Cortex这张附图展示了Opto2P-FCM在视觉皮层深处进行双色成像的情况。
左侧的图像展示了在固定头部的小鼠的颅窗调整距离时，红通道和绿通道收集的图像。
右侧的图像展示了成像体积的3D重建。
Summary
本文介绍了一种创新的微型双光子显微镜——Opto2P-FCM，它结合了双光子成像和光遗传刺激技术，用于在自由移动的动物中进行高分辨率的神经活动成像和精确的细胞操控。这项技术的开发是为了解决在活体动物中实现神经活动精确控制和观察的挑战，尤其是在自由移动的条件下。
Opto2P-FCM的设计采用了MEMS扫描器和紧凑型光学系统，使其能够附着在动物头部进行成像，同时通过第二光路进行模式化的双光子光刺激。这种设计不仅减轻了设备的重量，降低了系统的复杂性，而且提高了其在实际应用中的灵活性和实用性。通过使用两个不同的激光器（920 nm和1030 nm），Opto2P-FCM能够分别进行激发光传递和光刺激，通过偏振保持光纤和相干光纤束实现高效的能量传递和荧光收集。
文章中的实验部分展示了Opto2P-FCM在活体小鼠中进行高分辨率成像和光遗传刺激的能力。通过在小鼠的视觉和体感皮层中表达钙指示剂jGCaMP7s和光敏感蛋白ChRmine，研究者能够观察到与光刺激同步的神经元活动变化。这些结果证明了Opto2P-FCM在自由移动动物中进行细胞特异性操控和成像的潜力。
此外，文章还详细描述了Opto2P-FCM的光学设计、组装和性能模拟。通过在Zemax中的光线追踪和点扩散函数模拟，研究者验证了系统的光学性能，包括在不同扫描角度下的聚焦性能和光刺激光的均匀性。这些模拟结果为Opto2P-FCM的设计提供了重要的参考，并确保了其在实际应用中的性能。
Opto2P-FCM的开发是神经科学领域的一个重要进步，它为研究者提供了一种新的工具，可以在自由移动的动物中进行精确的神经活动控制和观察。这种技术的应用有望推动对大脑功能、认知过程、感觉知觉、运动控制和情感等复杂神经活动的理解。随着进一步的研究和开发，Opto2P-FCM及其衍生技术可能会在神经科学研究、疾病模型的开发和潜在的新疗法探索中发挥关键作用。
总之，本文介绍的Opto2P-FCM是一种集成了先进成像和光遗传学技术的微型双光子显微镜，它在自由移动的动物中进行高分辨率神经成像和精确的细胞操控方面展现出巨大的潜力。这项技术的进一步发展和应用将为神经科学研究提供新的视角和工具，有助于揭示大脑如何控制行为的深层机制。
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