为多光子成像装置寻找理想的超快激光源并非易事。它是峰值功率、脉冲能量和激光波长之间的精细平衡。在这篇白皮书中，我们讨论了重要的激光参数以及这些激光参数对结果质量的影响。
背景
多光子和高阶谐波生成显微镜特别适用于高分辨率三维和活细胞成像，其中单光子技术受到离焦荧光背景和穿透深度的限制。基于多光子相互作用的成像技术，如两个或三个光子激发和高阶谐波生成，如二次或三次谐波生成（SHG或THG）成像，已成为许多生物医学研究或临床诊断应用中非常有吸引力的工具，因为它们提供了具有减少组织损伤的高对比度成像能力，而不一定需要人工诱导的荧光染料。
为了发生多光子激发，入射光子必须在同一时间和地点到达样品，以增加单个荧光化合物同时发生多光子吸收事件的概率，这意味着多光子激发的效率在很大程度上取决于脉冲期间入射光的峰值强度。因此，脉冲越短，峰值强度越高，产生的信号越强。
由于多光子显微镜和高阶谐波成像中对光强度的非线性依赖性，信号也仅从焦平面内收集，激发光几乎不产生离焦发射。由此产生的受限多光子激发体积特别适用于活细胞成像，因为它导致更高的深度分辨率和明显更少的样品光损伤，从而延长了细胞的生存能力。
此外，多光子成像中使用的较长波长由于散射较低而增加了对样品的穿透深度。因此，多光子显微镜在需要对活细胞和组织进行深度穿透和成像的实验中通常优于其他技术。多光子激发和高阶谐波成像需要高峰值强度，这就要求使用具有超短飞秒脉冲的锁模激光器。为了触发大量多光子吸收事件，脉冲期间的光子密度必须比单光子吸收中的光子密度大几个数量级。先前发表的结果[1，2]表明，即使比通常使用的100-200fs的脉冲持续时间更短的脉冲，也能降低细胞致死率，并允许进行更长期的活细胞成像。在这篇白皮书中，我们展示了使用50 fs以下的脉冲激光器可以产生非常明亮的多光子和高阶谐波图像，同时保持平均值。
成像深度–更长波长？
三维成像中的初始考虑之一是在选定的激光波长下的样品透明度。在大多数组织中，由于组织的不均匀性，穿透深度受到光散射的限制。
光在各向异性介质中散射，但较长的波长比较短的波长经历较少的散射，因此允许更深的光学切片、更大的穿透深度和对厚样品的三维成像。光散射（瑞利散射）的标度为1/λ^4，这意味着在1050 nm处的散射比在800 nm处少约3倍。尽管更长的NIR波长（例如。1.3µm或1.7µm）将进一步减少光散射效应，使用1050 nm左右的波长可以获得出色的深层组织显微镜结果.
吸收-更短的波长？
如图1所示，穿透深度的另一个挑战是样品内的吸收，尤其是水的吸收，对于较长的近红外波长来说，这一挑战越来越明显。用D2O交换水可以在一定程度上帮助缓解这种情况，但需要降低激光功率以避免样品加热。组织的主要化学成分是水，图1中水的吸收截面可以用来帮助确定合适的激发波长。可以看出，吸水率在可见区域是最低的。在每毫米吸收0.2%的光的情况下，在800nm附近也存在最小局部吸收。
然而，对于三光子显微镜，800nm的波长带来了样品发射的信号在UV范围（800/3nm＝266nm）内的问题，这在偶发检测中是一个重大挑战，其中发射的光与激发光行进相同的路径。样品发出的光穿过聚焦激发光的同一显微镜物镜，激发光通常具有有限的紫外线透射，尤其是在350nm以下。因此，对于偶发性检测，应选择足够长的波长以最小化光散射并避免三阶信号的不良UV透射，但足够短以最小化吸水性。因此，在散射和吸收方面，使用大约1050nm的中心波长提供了最佳条件。此外，通过使用非常短（低于50）的fs脉冲，可以实现高信噪比和深穿透深度，同时保持平均激光功率下降。
避免加热-降低平均功率
水在约1050纳米处的光学吸收量为每毫米路径长度的约2%，这是相当可观的，但仍比在1700纳米处低几个数量级。在1050 nm处，100 mW的平均功率聚焦到0.5 x 0.5 mm2的视场（FOV）中，这导致每mm3 8 mW的局部热沉积（0.02100/0.50.5），这可能导致每秒约2度的温度升高（水的比热：4.2 J.g-1.K-1）[5]。对于大多数组织来说，当温度升高1度时，不会产生重大问题，但对于更敏感的组织，如有滞留空气的肺组织，由于空气的膨胀，样本可能会显示出显著的“动力学”。此外，在这种功率下，长时间暴露在单个区域会导致所有组织出现热问题。在FOV较小的情况下，平均功率沉积在较小的体积上，并且热加热增加并与FOV面积成反比[5].幸运的是，在0.5mm的长度尺度下，热扩散也以秒的时间尺度发生（组织的热扩散常数约为0.1mm2/s），这有助于去除热量。然而，对于高平均功率来说，以足够快的速度去除产生的热量以避免在组织中引起热问题或损伤是不可避免的挑战。因此，在尽可能低的平均激光功率下实现最佳图像质量是非常令人感兴趣的。
为什么低于50 fs的脉冲会产生更亮的信号
多光子和高阶谐波信号非线性地依赖于激光峰值功率。高强度增加了同时发生多光子吸收事件的可能性，SHG和THG信号分别与入射光强度的平方和立方成比例。因此，对于激光峰值功率的增加，相应的信号增加是实质性的。因此，超短亚50fs脉冲显著提高了多光子效率和高次谐波产生效率，从而显著提高了图像亮度。图2显示了SHG和THG信号强度与脉冲持续时间[1，2]（SHG强度~1/τ）之间的逆关系。然而，为了通过实验应用这种关系，准确地确定样品处的脉冲持续时间是至关重要的。如果显微镜光学器件中的色散没有得到适当补偿，脉冲将被拉伸，并且将在样品处测量较低的峰值功率。在这种情况下，脉冲持续时间和高次谐波产生效率之间的关系无法通过实验精确验证。为了产生足够的非线性SHG和THG信号，以在对样本温和的平均功率水平下实现所需的信噪比，50 fs以下的脉冲和色散预补偿的使用是必不可少的。
图2：SHG和THG强度与脉冲持续时间的关系
图3a）显示了来自校准网格的三次谐波信号，样品的平均功率为4.7mW，具有VALO系列飞秒激光器的全带宽，产生约40fs脉冲。在图3b）中，激光器的光谱带宽被限制在1064nm附近的10nm FWHM，产生约160 fs的脉冲。图3a）和3b）中的图像具有相同的比例，但图3b）中没有显示THG信号。只有在从较长的~160fs脉冲中重新缩放较低的THG信号后，才有可能获得高于实验噪声基底的图像，如图3c）所示。在这种情况下，需要高2.5倍的平均激光功率来实现与从较短的50 fs以下脉冲获得的THG信号的信噪比相当的信噪比来实现。总之，超短亚50fs脉冲提供了相当高的脉冲峰值功率，这导致了在低得多的平均功率下的最佳信噪比图像，这反过来减少了光漂白，并延长了细胞活力。
图3：具有50微米正方形的校准网格（Ibidi）的三次谐波。a） 4.7 mW，全谱短脉冲（<50 fs；VALO系列）。b） 6mW，激光光谱限制在10nm带宽（~160fs）。c） 6 mW激光光谱的放大对比度限制在10 nm带宽（~160 fs）。
强脉冲-THG的优势
THG显微镜是一种高分辨率的深层光学切片和无标记成像技术，可以减少组织损伤，不需要人工诱导的荧光探针，但它需要更高的峰值功率和更短的脉冲，同时保持较低的平均激光功率来延长细胞存活力。内源性生物分子的发射和自然产生的二阶谐波信号对某些发色团具有化学特异性，并且仅在胶原等非中心对称分子中产生。THG信号的化学特异性特别低，并且折射率的每一个空间变化都能够产生THG信号。因此，THG显微镜可以被视为相位对比显微镜的3D等效物[6]。特别地，折射率的局部变化在激光焦点尺寸的一半以内在产生THG信号方面特别有效。由于焦点中的Gouy相移，焦点前后的激光场相差180度。对于所有三阶（和奇数阶）信号也是如此，其中信号具有相消干扰并抵消。因此，THG信号不是在均匀介质中产生的，并且需要在焦点内打破对称。由于该通用原理，可以观察到蜂窝和亚蜂窝细节，有些发出微弱的信号，有些发出强烈的信号。这要求强烈的脉冲使强和弱特征都可见，并要求具有高动态范围的检测系统。由于THG信号与脉冲的峰值功率的立方成比例，为了产生所需的高信噪比，需要使用相当大的强度，从而更短的脉冲。图4a）和4b）显示了使用脉冲持续时间低于50fs的VALO系列激光器获得的小鼠大脑图像，并强调需要超短脉冲来增强THG成像。
图4：小鼠大脑THG信号a）大图像马赛克，b）特写图像（200µm x 200µm）
在光漂白之前，分子经历了几个激发/发射循环，有些可能更敏感，而另一些可能在额外的入射光子无法激发更多分子之前经历了几个循环。在延时显微镜中，当长时间观察活细胞或组织时，光损伤是主要的限制因素之一。虽然光毒性是分子结构和实验环境的函数，但它不可避免地会因持续暴露于高平均激光功率而加速。因此，对于对光毒性敏感的活细胞成像，由低于50fs的脉冲递送的低平均激光功率和高峰值功率的组合增强了细胞活力并显著延长了成像时间。如表1所示，将50fs与200fs进行比较，对于相同的峰值功率，仅需要平均功率输出的四分之一的激光器，这转化为更长的成像持续时间，同时提供相同的双光子效率（TPEF）。为了实现尽可能低的平均功率，优选较低的重复率激光器，这也有助于减少光漂白效应。
| 脉宽 |
峰值功率
（30MHz）
|
平均功率
*For the same TPEF
|
| 200fs |
16 kW |
100 mW |
| 50fs |
16 kW |
25 mW |
表1：脉冲持续时间、峰值和平均功率比较
图5显示了使用VALO系列sub 50 fs脉冲激光在没有组织损伤的情况下进行髓鞘形态的THG成像和延长的延时采集（超过一小时）。在胼胝体膝内观察到轴突和轴突髓鞘膜，可以研究钠离子通道在多发性硬化症（MS）中的作用。
图5：在逐渐高钠灌注过程中诱导髓鞘肿胀的时间推移成像，这是表征多发性硬化症（MS）发作的指标。
亚50fs光纤激光器
基于光纤的飞秒激光器由于其鲁棒性、灵活性、易用性和低拥有成本，已成为各种多光子和高谐波成像应用的非常有吸引力的来源。紧凑型VALO Aalto和VALO Tidal激光器以30MHz的重复频率提供亚50fs脉冲，脉冲能量分别为6.6nJ和66nJ，平均功率分别为200mW和2W。它们产生了无对准的高质量光束轮廓（Aalto的典型M2＜1.1，Tidal的典型M2＞1.2）和集成色散预补偿模块。为了充分受益于低于50fs的脉冲，必须预先补偿光路分量中的色散，以在样品处实现可能的最高峰值功率。VALO系列sub 50 fs脉冲激光器采用被动冷却，无需风扇或水冷却。它们的短脉冲和由此产生的高脉冲峰值功率允许更高的光子转换效率，同时减少光损伤并提高细胞活力。
两种VALO激光器都内置在一个紧凑而坚固的封装中，适合集成到工业筛选工具和台式分析仪器中。VALO系列激光器的典型时间脉冲轮廓和光束轮廓的示例如图6a）所示，以及宽光谱的示例6b）和激光器的图片6c）。
图6:a）典型的脉冲宽度和光束轮廓，b）c）HÜBNER Photonics VALO系列飞秒激光器的典型光谱。
展望
多光子显微镜在各种应用中具有巨大的潜力，包括开发未来的诊断筛查系统。VALO系列飞秒激光器在50 fs以下范围内提供脉冲，并提供前所未有的多光子转换效率和强大的峰值功率。这反过来又有助于推动无标签多光子应用的前沿，特别是在三次谐波成像中，因为它能够实现高灵敏度的扩展活细胞成像和延时测量。
参考文献
[1] Shuo Tang, Tatiana Krasieva, Zhongping Chen, Gabriel Tempea, Bruce Tromberg (2006), Effect of pulse duration on
TWo-photon excited fluorescence and second harmonic generation in nonlinear optical
microscopy, Journal of Biomedical Optics, 11(2).
[2] Mira Sibai, Hussein Mehidine, Fanny Poulon, Ali Ibrahim, M. Juchaux, J. Pallud, A. Kudlinski, Darine Haidar (2018), The Impact of Compressed Femtosecond Laser Pulse Durations on Neuronal Tissue Used for Two-
Photon Excitation Through an Endoscope, Scientific Reports, 8:11124.
[3] G.M Hale and M. R. Querry (1973), Optical Constants of Water in the 200-nm to 200-microm Wavelength Region, Appl. Opt., 12, 555-563.
[4] Gert-Jan Bakker, Sarah Weischer , Júlia Ferrer Ortas, Judith Heidelin, Volker Andresen, Marcus Beutler, Peter Friedl (2022), Intravital Deep-Tumor Single-Beam 2-, 3- and 4-Photon Microscopy, eLife 11.
[5] K. Giering , O. Minet , I. Lamprecht , G. Müller (1995), Review of thermal properties of biological tissues, SPIE PM, 25, 45-65.
[6] Stephen A. Boppart, Sixian You, Lianhuang Li, Jianxin Chen, and Haohua Tu (2019), Simultaneous label-free utofluorescence-multiharmonic microscopy and beyond, cAPL Photon 4.
鸣谢
这项工作是与Flash病理学和阿姆斯特丹Vrije大学合作进行的。
作者
Dr. Frank van Mourik
Inventor & CTO – Flash Pathology, Amsterdam, The Netherlands
Dr. Marloes Groot
Full Professor, Biophotonics and Medical Imaging, Faculty of Science, LaserLab, Vrije Universiteit Amsterdam, The Netherlands
Niels Meijns
PhD student
, Anatomy & Neurosciences – Amsterdam UMC
Dr. Oliver Prochnow
CEO – VALO Femtosecond lasers – HÜBNER Photonics, Hannover, Germany
Dr. Wissam Nakhle
Product Manager – VALO Femtosecond lasers – HÜBNER Photonics, Hannover, Germany
